Kaiser, Björn Peter:

Regulation der Internalisierung , Desensibilisierung und Down-Regulation von muskarinischen Acstylcolin-Rezeptoren durch Rezeptorkinasen, Intersectin, Endopilin und Ubiquitin

Duisburg-Essen (2003), V, 95 Bl.
Dissertation / Fach: Biologie
Fakultät für Biologie
Medizinische Fakultät » Universitätsklinikum Essen » Institut für Pharmakologie
Dissertation
Abstract:
Extrazelluläre Signalmoleküle, wie Hormone, Neurotransmitter und Mediatoren binden in der Regel an membranständige Rezeptoren und lösen eine Kaskade von zellulären Reaktionen aus, die zu einer spezifischen Zellantwort führen. Die größte Gruppe der membranständigen Rezeptoren sind die sog. G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRen), die nach Bindung von spezifischen Agonisten nachgeschaltete heterotrimere G-Proteine aktivieren, worüber unterschiedliche Signaleffektoren, wie die Adenylylcyclase, die Phospholipase C oder Ionenkanäle aktiviert oder gehemmt werden. Die muskarinischen Acetylcholin-Rezeptoren (mAChRen) mit ihren bekannten Subtypen M1 - M5 gehören zur GPCRSuperfamilie. Ähnlich wie andere GPCRen unterliegen auch die mAChRen selbst einer Regulation. Dies betrifft einmal die Abschwächung der Signalweiterleitung (Desensibilisierung) sowie die Internalisierung und den Abbau (Down-Regulation) der Rezeptoren. Für die beiden ersten Prozesse ist es anscheinend erforderlich, daß die Rezeptoren durch Rezeptorkinasen phosphoryliert werden, an die dann Adapter-Proteine wie ?-Arrestin binden, was dann die Desensibilisierung und Internalisierung der Rezeptoren auslöst. Frühere Untersuchungen an den mAChR-Subtypen hatten ergeben, daß die M1, M3 und M4 mAChRen unter Beteiligung von ?-Arrestin über sog. clathrin-coated vesikel (CCV) in HEK293-Zellen internalisieren und daß sie anschließend wieder an die Zelloberfläche zurückkehren. Im Gegensatz dazu internalisiert der M2 mAChR nicht über CCV, sondern wird über andere, bisher noch nicht bekannte Vesikel in das Zellinnere transportiert und anschließend in der Zelle abgebaut. Für die Vesikel-Abschnürung bei der mAChR-Internalisierung ist Dynamin für alle vier mAChR-Subtypen essentiell. Ziel dieser Arbeit war es, die Rolle der beiden Rezeptorkinasen Caseinkinase 1? (CK1?) und G-Protein-gekoppelte Rezeptorkinase 2 (GRK2) sowie der Proteine Intersectin, Endophilin und Ubiquitin bei der Desensibilisierung, Internalisierung und Down-Regulation der mAChR-Subtypen M1 - M4 zu charakterisieren. Die Untersuchungen, die mittels transienter oder stabiler Expression der M1 - M4 mAChRen und der genannten Proteine sowie von spezifischen Mutanten dieser Proteine in HEK293- und HEK293 tsA201-Zellen durchgeführt wurden, zeigten hinsichtlich der beiden Rezeptorkinasen, daß die GRK2, aber nicht die CK1? für die Desensibilisierung und Internalisierung des M2 mAChRs sowie für die Internalisierung des M4 mAChRs verantwortlich ist. Dagegen kann die Internalisierung des M1 mAChRs sowohl durch CK1? als auch GRK2 reguliert werden, während die Internalisierung des M3 mAChRs weder durch CK1? noch durch GRK2 wesentlich gesteuert wird. Weitergehende Untersuchungen zur CK1?, die die M1 und M3 mAChRen in einer Agonist-abhängigen Weise phosphoryliert, ergaben, daß die CK1? weder bei der akuten Signaltransduktion (Stimulation von Phospholipase C und D, Calcium-Freisetzung und Aktivierung von Mitogen-aktivierten Proteinkinasen) über diese mAChR-Subtypen noch ihrer Desensibilisierung beteiligt ist. Studien mit heterologer Expression von Wildtyp Intersectin und der fünf isolierten SH3-Domänen (SH3A - E) dieses Proteins ergaben, daß Intersectin wahrscheinlich über seine SH3E- und SH3D-Domänen die Internalisierung des M2 mAChRs negativ reguliert. Die Wirkung der SH3E-Domäne erfolgt offensichtlich über eine Interaktion mit Dynamin, während die SH3D-Domäne mit einem bisher nicht identifizierten Protein interagiert. Interessanterweise wurde die Geschwindigkeit der Internalisierung des M1 mAChRs durch Expression der SH3A-, SH3D- und SH3E-Domänen von Intersectin gesteigert. Hiermit konnte erstmalig eine Beteiligung von Intersectin bei der Internalisierung von GPCRen gezeigt werden. Endophilin ist ein für die Invagination und Endozytose von synaptischen Vesikeln essentielles Protein, das über seine SH3-Domäne mit verschiedenen anderen Proteinen, wie Dynamin, Synaptojanin oder auch Rezeptoren interagiert. Untersuchungen mit Wildtyp Endophilin und seiner isolierten SH3-Domäne ergaben, daß die Internalisierung der M2 und M4 mAChRen, aber nicht die der M1 und M3 mAChRen durch Endophilin reguliert wird. Diese Regulation erfolgt wahrscheinlich über eine Interaktion von Endophilin mit Dynamin, während keine Hinweise für eine Beteiligung der Inositol-5-Phosphatase Synaptojanin oder eine direkte Interaktion von Endophilin mit mAChRen gefunden wurden. Da im Gegensatz zu den anderen mAChR-Subtypen internalisierte M2 mAChRen nicht mehr an die Plasmamembran zurückkehren, sondern intrazellulär abgebaut werden, wurde geprüft, ob eine Ubiquitinylierungsreaktion bei der Internalisierung und Down-Regulation des M2 mAChRs beteiligt ist. Untersuchungen mit einer Ubiquitin-Mutante, die eine Multi-Ubiquitinylierung von Proteinen verhindert, ergaben, daß die Internalisierung und Down-Regulation des M2 mAChRs, aber nicht die der M1 und M4 mAChRen, von einer Multi-Ubiquitinylierungsreaktion abhängig sind. Weiterhin konnte die Down-Regulation des M2 mAChRs sowohl durch spezifische proteasomale als auch durch lysosomale Hemmstoffe unterbunden werden. Auch wenn das hierbei beteiligte Ubiquitin-Target bisher nicht identifiziert wurde, so lassen diese Ergebnisse den Schluß zu, daß das oben erwähnte besondere Verhalten der internalisierten M2 mAChRen möglicherweise darauf beruht, daß die Internalisierung dieses Rezeptors von einer Multi-Ubiquitinylierungsreaktion begleitet ist, die ihn zum proteasomalen und lysosomalen Abbau hinführt und damit seine Rückkehr an die Plasmamembran verhindert.

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