Gellhaus, Alexandra:

Einfluß verschiedener Gap Junction-Kanäle auf das Proliferations-, Invasions- und Differenzierungsverhalten der Chorionkarzinomzellinie Jeg 3

Duisburg-Essen (2003), VI, 137 S.
Dissertation / Fach: Allgemeines, Sonstiges
ehem. Fakultät für Biologie und Geografie
Dissertation
Abstract:
Gap Junction-Kanäle spielen eine bedeutende Rolle in der Kontrolle der Zellproliferation und Zelldifferenzierung. Die bei dieser Kontrolle durch Connexine ablaufenden Regulations-mechanismen sind jedoch noch weitgehend ungeklärt. In dieser Arbeit wurde daher die humane Chorionkarzinomzellinie Jeg3, die maligne Form des Trophoblasten, mit verschiedenen Connexin-Genen stabil transfiziert, um den Einfluß verschiedener Gap Junction-Kanäle auf das Proliferations-, Invasions- und Differenzierungsverhalten des Trophoblasten zu analysieren. Die Jeg3-Chorionkarzinomzellen dienen als Modell für den frühen proliferativen Trophoblasten und sind kommunikationsdefizient. Die Untersuchung fokussierte sich auf den Cx43- und Cx40-Kanal, da diese beiden Connexine unterschiedliche Funktionen in der Trophoblast-Differenzierung besitzen. Dabei übernimmt Cx40 vermutlich die Aufrechterhaltung der Proliferation, während Cx43 im Prozeß der Differenzierung zum Synzytiotrophoblasten involviert ist. Ein C-terminal trunkiertes Cx43-Konstrukt (trCx43) wurde eingesetzt, um den Einfluß des C-Terminus auf Signaltransduktionsprozesse zu untersuchen. Im Rahmen dieser Arbeit konnten induzierbare Jeg3-Cx-Transfektanten (Cx43, Cx40, Cx26, trCx43) unter der Kontrolle des Tet-On-Systems und Cx43-Transfektanten mit dem zellspezifischen ? hCG-Promotor etabliert und hinsichtlich ihres Cx-Expressionsmusters und funktionellen Kopplungsgrades charakterisiert werden. Ferner wurden Analysen des Invasionsverhaltens der Cx-transfizierten Jeg3-Zellen durchgeführt. Dazu wurde die heterologe Kopplungsfähigkeit der verschiedenen Jeg3-Cx-Transfektanten mit der Maus-Endothelzellinie bEnd3 in vitro untersucht. Während die mit Cx43 transfizierten Jeg3-Zellen mit den Endothelzellen heterolog koppeln konnten, unterblieb diese Kopplung bei den Cx26-Zellklonen. Untersuchungen des in vivo-Invasions-verhaltens der verschiedenen Cx-Transfektanten in Tumoren von Nacktmäusen zeigten nur wenige Unterschiede. Die Cx43-Tumore wiesen tendenziell mehr Cx43-positive Riesenzellen als die Cx40-Tumore auf. Es waren keine Veränderungen in der Ausbildung / Einsprossung von Gefäßen sowie in der Integrin-Expression der Tumore zu erkennen. Der einzige Unterschied war eine höhere Expression des EGF-Rezeptors in den Cx43-Tumoren. Zellphysiologische Untersuchungen der verschiedenen Cx-Transfektanten zeigten Unterschiede im Proliferationsverhalten. Eine Wiederherstellung der Zell-Zell-Kommunikation über den Cx43-Kanal führte zu einer signifikanten Reduktion der Zellproliferation in vitro und des Tumorwachstums in Nacktmäusen. Dagegen wiesen die Cx40- und trCx43- Transfektanten kein reduziertes Wachstumsverhalten sowohl in vitro als auch in vivo auf, sondern zeigten teilweise in den Nacktmausversuchen ein verstärktes Tumorwachstum. Die Analysen der ? hCG-mRNA-Expression und ? hCG-Sekretion als Marker für eine verstärkte Differenzierung zeigten Tendenzen zu einer verstärkten ? hCG-Produktion in den Cx43-Transfektanten. Zusammenfassend stützen diese Daten die Befunde, daß Cx43 an der Reduktion der Proliferation und an einer Verstärkung der Differenzierung beteiligt ist. Um die Cx-vermittelte Signalkaskade, die zu dem reduzierten Proliferationsverhalten der Cx43-transfizierten Jeg3-Zellen führt, aufzuklären, wurden Gene-Arrays und semiquantitative RT-PCR-Analysen der Jeg3-Transfektanten durchgeführt. Dabei konnte das Wachstums-regulator-Gen NOV, ein Mitglied der CCN-Familie der sekretierten mit der extrazellulären Matrix assoziierten Proteine, als hochreguliertes Gen in den Cx43-Transfektanten identifiziert werden. In immunhistochemischen Analysen wurde NOV in parentalen Zellen überwiegend im Zellkern nachgewiesen. Nach Induktion von Cx43 in den Tet/Cx43-Transfektanten konnte eine Kolokalisation von NOV und Cx43 an der Zellmembran mittels der Doppel-Immunfluoreszenz beobachtet werden. Keine Kolokalisation war in den induzierten Cx40-und C-terminal trunkierten Cx43-Transfektanten sowie in allen uninduzierten Zellklonen zu detektieren. Dort war NOV nicht an der Zellmembran, sondern vor allem im Zellkern und z.T. im Zytoplasma lokalisiert. Daraus war zu schließen, daß möglicherweise der C-Terminus von Cx43 an der Bindung des NOV-Proteins beteiligt ist. Die Assoziation von NOV und Cx43 an der Zellmembran könnte für die Wachstumsreduktion der Jeg3-Cx43-Transfektanten verantwortlich sein. Insgesamt sprechen die Befunde dieser Arbeit dafür, daß sowohl die Proliferation als auch die Differenzierung der Jeg3-Zellen eng mit der Expression bestimmter Cx-Isoformen verknüpft ist. Zudem wird durch die Assoziation von NOV und Cx43 die Funktion der Connexin-Proteine unabhängig von der Bildung von Gap Junction-Kanälen deutlich und zeigt den zunehmenden Einfluß der Beteiligung anderer Proteine an der Cx-vermittelten Signalkaskade. Auch die Daten der Gene-Array-Analyse sprechen für die Komplexität der Gap Junction vermittelten interzellulären Kommunikation über intrazelluläre Signalkaskaden.

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