Abstract:

In der internistischen Onkologie gehören die Substanzen Cis- und Carboplatin seit Jahren zu den wirksamsten Zytostatika bei der Behandlung solider Tumoren. Die molekularen Mechanismen der therapeutischen Wirkungen und Nebenwirkungen dieser Verbindungen, sowie die Ursache(n) eines Therapieversagens sind multifaktoriell und in ihrer Komplexität bisher weitgehend unverstanden geblieben. Die Aufkärung dieser pharmakokinetischen und pharmakodynamischen Prozesse ist die Grundlage jeder chemoprotektiven bzw. resensitivierenden Intervention und damit des Fernziels einer individualisierten Chemotherapie. Die Einwirkung von Cis- bzw. Carboplatin auf die zelluläre DNA ist interindividuell und Zelltyp-spezifisch sehr unterschiedlich. Unter anderem kontrollieren die Nierenfunktion, der Wirkstoffimport- und -export über die Zellmembran, sowie zytoplasmatische Detoxifizierungsprozesse das Ausmaß der initialen Pt-DNA Adduktbildung. Ähnlich heterogen ist die Leistungsfähigkeit der zellulären DNA-Reparatursysteme und schließlich die Toleranz der Zellen gegenüber bestehenden Läsionen. Wie die klinische Bedeutung dieser Faktoren für eine primäre oder erworbene Platin-Resistenz zu bewerten ist, kann bislang nicht beantwortet werden. Im Rahmen klinisch realisierbarer Pt-Dosen ist die Möglichkeit, Tumorzellen zur Auslösung der Apoptose zu provozieren, wahrscheinlich das entscheidende Kriterium für ihre therapeutische Ansprechbarkeit. Bisher ist ungeklärt, welchen Anteil die einzelnen, strukturell verschiedenen Pt-DNA Addukte an diesem zytotoxischen Potential von Cis- und Carboplatin haben. Da Bildung und Elimination dieser Addukte im Zentrum des pharmakologischen Geschehens stehen, ist die Entwicklung einer hinreichend empfindlichen Methode zur quantitativen Bestimmung definierter Platin-DNA-Läsionen auf dem Niveau individueller Zellen, d. h. eine molekulare Dosimetrie, der erfolgversprechenste Weg zur Beantwortung der offenen Fragen. In dieser Arbeit wurden mit dem Ziel einer immunhistochemischen Einzelzell-Analytik monoklonale Antikörper gegen die verschiedenen Pt-DNA Addukte generiert und charakterisiert. Cisplatin-induzierte DNA Addukte sind in einen stereochemischen Kontext eingebunden, der offenbar weit über die koordinativen Bindungen der eigentlichen Läsion hinausreicht. Es konnte in diser Arbeit gezeigt werden, daß die Nachahmung dieser Raumordnung mit platinierten Oligonukleotiden nicht möglich ist. Daher führt der "klassische" Weg zur Generierung von spezifischen monoklonalen Antikörpern, d. h. die Immunisierung mit einem strukturell eindeutigen Antigen, nicht zum gewünschten Ziel. Aus diesem Grund wurde hier ein ganz neues Verfahren entwickelt: Die Immunaktivität der geimpften Tiere wurde mit platinierter DNA als Antigen zunächst gegen ein komplexes Epitopgemisch, d. h. gegen die Summe aller Addukte gerichtet. Anti-(Pt-DNA) positive Hybridome wurden nach der Fusion mit einem immunomagnetischen Separationsverfahren isoliert und kloniert. Zur Charakterisierung ihrer Epitop-Spezifität wurden in einem weiteren Schritt den so generierten MAK auf DNA-Fragmenten vereinzelte Pt-Addukte zur Bindung angeboten. Die vom jeweiligen Antikörper erkannten Epitope wurden dann über ein Festphasen-Adsorptionsverfahren isoliert und die Platin-Addukte mit Hilfe einer 32 P-Postlabelling- assozierten Radiochromatographie strukturell identifiziert. Weit über die Platinanalytik hinaus bietet das in dieser Arbeit erstmals entwickelte "retrospektive" Verfahren Zugang zu Strukturen, die von DNA-reaktiven Proteinen (wie z. B. Komponenten des DNA-Reparatursystems, von Faktoren der Genregulation oder von Strukturelementen der Chromatinarchitektur) im nativen Kontext erkannt und gebunden werden.