Burlon, Oliver:

Expression und Aufreinigung von Connexinen für ESR-spektroskopische Untersuchungen

Essen (2001)
Buch / Monographie / Fach: Allgemeines, Sonstiges
Medizinische Fakultät » Universitätsklinikum Essen » Institut für Anatomie
Fakultät für Biologie
Abstract:
In dieser Arbeit konnte erstmals ein Connexin, Cx43, stabil in Insektenzellen exprimiert werden. Dieses heterologe Expressionsystem ermöglicht die posttranslationale Aggregation der Connexine zu Halbkanalstrukturen. Die vergleichweise schnelle Etablierung stabiler, überexprimierender eukaryonter Transfektanten ist im Hinblick auf das für die ESR-Spektroskopie typische Cysteinscreening von großem Vorteil. Für dieses Cysteinscreening konnte eine erste Cysteinmutante, K146C, kloniert und in den Insektenzellen zur Expression gebracht werden. Es konnte eine neue Aufreinigungsmethode für Connexine etabliert werden, die Zwei-Schritt-Gelfiltration. Sie erlaubt die Isolation hochreiner Cx-Halbkanäle unter nativen Bedingungen. Erste ESR-Spektren von Wildtyp-Cx43-Halbkanälen konnten aufgezeichnet werden. Sie belegen, daß drei der neun nativen Cysteine des Cx43 für die Spinsonde zugänglich sind und diese kovalent binden.

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