Abstract:

HtrA1 gehört zur Familie der HtrA (High temperature requirement) Serin-Proteasen, einer Gruppe hochkonservierter Proteasen, die sowohl eukaryotische als auch prokaryotische Mitglieder umfasst. Gemeinsames Merkmal dieser Serin-Proteasen ist das Vorhandensein einer hoch-konservierten Trypsin-ähnlichen Domäne und mindestens einer C-Terminalen PDZ-Domäne. HtrA1 wurde ursprünglich als weniger exprimiertes Gen in SV40-transfomierten Fibroblasten identifiziert und wird außerdem mit verschiedenen Krankheitsbildern, wie Arthritis, altersbedingter Makuladegeneration oder der Alzheimerschen Krankheit in Verbindung gebracht. In dieser Arbeit werden drei Kristallstrukturen von HtrA1 präsentiert. Sie zeigen die Protease Domäne in der inaktiven und aktiven Konformation. Beide Konformation weisen vergleichbare strukturelle Gegebenheiten im Vergleich mit anderen HtrA Familienmitgliedern auf. Zugleich werden aber signifikante Besonderheiten für HtrA1 deutlich. Interessanterweise ist die Bindung des Peptid-Inhibitors in das aktive Zentrum der Protease Domäne ausreichend, um konformationelle Änderungen hervorzurufen, die durch Reorientierung der Schleifen, die das aktive Zentrum gestalten, von einer inaktiven zu einer aktiven Konformation führen. Schleife L3, die in der inaktiven Konformation ungeordnet ist, zeigt jetzt eine geordnete Konformation und definierte Interaktionen mit dem Inhibitormolekül. Diese Erkenntnis ist unterschiedlich zu vergleichbaren bekannten HtrA Strukturen in denen L3 eine geordnete Konformation durch spezifische Interaktionen mit der PDZ Domäne einnimmt. Im zweiten Teil der Arbeit stand die Entwicklung eines Aktivitäts-Assays und die Messung der enzymatichen Aktivität verschiedener verkürzter Versionen von HtrA1 im Vordergrund. Es wurden Inhibitoren und Peptide auf die Fähigkeit hin getestet, an HtrA1 zu binden und die enzymatische Aktivität zu regulieren. Dabei sollte vor allem die Rolle der PDZ Domäne untersucht werden. Die PDZ Domänen der bakteriellen HtrAs sind wichtig für die Erfassung von Protein Faltungsstress, sie sind Bindungsstellen für Substrate und regulieren die enzymatische Aktivität. Für das humane HtrA1 konnte gezeigt werden, dass die PDZ Domäne entbehrlich für die katalytische Aktivität ist, aber eine Rolle für die allosterische Regulation von HtrA1 spielt. Außerdem beeinflusst die PDZ Domäne die Produktlänge von geschnittenen Substraten. Vor allem interessant ist, daß die Daten auch auf die Möglichkeit hindeuten, daß die Protease durch einen konservierten Mechanismus der Oligomerisierung reguliert wird. Dieser Mechanismus der Regulation durch Oligomerisierung wurde zuerst für das bakterielle Familienmitglied DegP beschrieben (Krojer et al. 2008), konnte aber nicht für bakterielles DegS oder humanes HtrA2 gezeigt werden. Es ist daher spannend zu spekulieren, dass HtrA1 analog zu DegP ein Molekül darstellt, das in der Lage ist ungefaltete oder fehlgefaltete Proteine zu sequestrieren, um sie der Rückfaltung oder dem Abbau zuzuführen. Damit könnte es ein Teil der Stressantwort auf ungefaltete Proteine in der ECM sein, ein Qualitäts-Kontrollsystem das noch nicht sehr charakterisiert ist. Obwohl die hier präsentierten Kristallstrukturen von HtrA1 und die biochemischen Analysen unser Wissen über HtrA1 erweitern, ist die Zahl der offenen Fragen immer noch immens. Die dargestellten Ergebnisse können somit die Grundlage für wichtige Experimente in der Zukunft bilden, die einen weiterführenden Einblick in den Mechanismus der Aktivierung der humanen Serin-Protease HtrA1 ermöglichen.