Lütticke, Christiane:

Charakterisierung der putativen Metalloproteasen YfgC und YggG im Periplasma von E. coli

Duisburg, Essen (2010), 173 Bl.
Dissertation / Fach: Biologie
Fakultät für Biologie
Zentrale wissenschaftliche Einrichtungen » Zentrum für Medizinische Biotechnologie (ZMB)
Ehrmann, Michael (Doktorvater, Betreuerin)
Kaiser, Markus (GutachterIn)
Duisburg, Essen, Univ., Diss., 2010
Abstract:
Die Zellhülle von E. coli besitzt ein System zur Proteinqualitätskontrolle, welche sowohl die richtige Faltung von Proteinen als auch den Abbau von fehlgefalteten, akkumulierten Proteinen gewährleistet. Dabei sind verschiedene Chaperone und Proteasen am Prozess der Proteinqualitätskontrolle beteiligt, wie z.B. das Hitzeschockprotein DegP (Spiess et al., 1999), die Prolinisomerase SurA und das Chaperon Skp (Vertommen et al., 2009). Die erwähnten Proteine machen jedoch nur einen kleinen Teil der periplasmatischen Proteinqualitätskontrolle aus. Viele Proteine, die in der Zellhülle agieren, sind bisher noch uncharakterisiert. Dabei beruhen deren Lokalisation und Funktion nur auf Annahmen aus Sequenzvergleichen und bioinformatischen Vorhersagen. Dazu gehören auch die uncharakterisierten Proteine YfgC und YggG, die anhand der Aminosäuresequenzen den Metalloproteasen zugeordnet werden. Sie besitzen das HEXXH-Motiv, welches in den Metalloproteasen der Familie M48 vorkommt. Die Proteasen dieser Familie wie z.B. HtpX und Oma1 sind oft in die Proteinqualitätskontrolle involviert. So ließ das Vorhandensein des HEXXH Motiv vermuten, dass auch YfgC und YggG an der Proteinqualitätskontrolle in E. coli beteiligt sind. Um diesem Hinweis nachzugehen, war das Ziel dieser Arbeit die in vivo und in vitro Charakterisierung dieser Proteine. Die Ergebnisse, die im Rahmen dieser Arbeit gewonnen wurden, lieferten zahlreiche interessante Erkenntnisse für die Metalloproteasen YfgC und YggG. So zeigte die Analyse unterschiedlicher Membranfraktionen, dass YfgC ein lösliches periplasmatisches Protein ist, obwohl es nach den `Transmembran Prediction Servern` DAS (URL: http://www.sbc.su.se) und TMPred (URL: http://www.ch.embnet.org) drei Transmembrandomänen besitzen soll. Zudem liegt es nach den Ergebnissen der Gelfiltration in vitro als Monomer vor. Um die physiologische Rolle zu untersuchen wurden transkriptionelle Promotor-lacZ-Fusionen hergestellt, die im Vergleich zu anderen Promotoren und unter verschiedenen Wachstumsbedingungen analysiert wurden. Für yfgC ergaben die Untersuchungen dieser Fusionen, dass es einen starken Promotor besitzt, vergleichbar mit dem von malK (Kühnau et al., 1991). Die weitere Charakterisierung der physiologischen Eigenschaften erfolgte durch die Untersuchung von Deletionsstämmen. Hierbei war vor allem der surA yfgC Deletionsstamm auffällig, der bei 42°C ein sehr schwaches Wachstum aufwies und dessen Bakterienzellen in den mikroskopischen Aufnahmen kleiner als die der Einzeldeletionsstämme waren. Zusätzlich zeigten Komplementationsassays, dass YfgC sowohl in aktiver als auch in inaktiver Form den surA yfgC Deletionsstamm komplemetieren kann. Diese Ergebnisse deuten daraufhin, dass SurA und YfgC redundante Funktionen und gleiche Substrate besitzen. Substrate von SurA sind z.B. Außenmembranproteine wie LamB und LptD (Ureta et al., 2007; Vertommen et al., 2009). Untersuchungen von Doppeldeletionsstämmen (Dissertation, J. Weski) lieferten erste Hinweise, dass LamB tatsächlich ein Substrat von YfgC darstellen könnte. Im Rahmen dieser Arbeit ließ sich die Interaktion von YfgC und LamB mittels Co-Immunpräzipitation bestätigen. Das Außenmembranprotein LptD erwies sich ebenfalls als ein potentielles Substrat von YfgC. Sowohl im Ganzzellextrakt als auch in der Außenmembranfraktion zeigte sich, dass LptD in den Proben, in denen das aktive YfgC überexprimiert wurde, in geringeren Mengen vorhanden ist. Um weitere native Substrate von YfgC zu identifizieren, wurden Außenmembrananalysen unter erhöhten Stressbedingungen (42°C und hoher Osmolarität) mittels Massenspektrometrie durchgeführt. Dabei erwiesen sich Lipoproteine als potentielle Substrate, unter anderem auch YggG. Zusammenfassend betrachtet führen die Ergebnisse dieser Arbeit zu der Annahme, dass YfgC in der Assemblierung von Außenmembranproteinen und der Proteinqualitätskontrolle, unter Stressbedingungen, involviert ist. YggG zeigte in der Co-Immunpräzipitation und in chemischen `Crosslinkreaktionen` eine Interaktion mit YfgC. Die Vermutung, dass YggG ein potentielles Substrat von YfgC ist, wurde dadurch belegt. Wie sich im Rahmen dieser Arbeit durch die Analyse von Zellfraktionen zeigte, ist YggG ein Lipoprotein mit Lokalisation in der Außenmembran. YggG besitzt eine hohe Substratspezifität. Die massenspektrometrischen Analysen des α-Caseinhydrolysats und die Untersuchung der daraus synthetisierten Peptide (P. Hauske AG Kaiser, CGC Dortmund) ergaben, dass YggG nur zwischen den Aminosäuren F/F schneidet. Mit Hilfe der Peptide wurde die Proteolyseaktivität von YggG in Abhängigkeit verschiedener Pufferbedingungen untersucht. Dabei wies YggG eine deutliche Aktivitätszunahme um 76%, bei einem pH-Wert von 6,0 in MES-Puffer mit einem Zusatz von 25 µM ZnCl2 auf. Wie im Rahmen dieser Arbeit ermittelt wurde, besitzt YggG eine Disulfidbrücke, die für die proteolystische Aktivität von Bedeutung ist. Die Disulfidbrücke hat einen Einfluss auf die Struktur von YggG, so wird reduziertes YggG zu einem Substrat der `Houscleaning`-Protease DegP. Der oligomere Zustand von YggG ist hingegen unabhängig von der Disulfidbrücke. Die Ergebnisse der Gelfiltration und chemischer `Crosslinks` zeigten, dass YggG in vitro sowohl in oxidierter wie in reduzierter Form überwiegend als Monomer vorliegt. Zu Charakterisierung der physiologischen Bedeutung, wurden Genomearrays von yfgC und yggG Deletionsstämmen, den entsprechend komplementierten Stämmen und dem Wildtyp BW30270 durchgeführt. Die Ergebnisse wurden zusätzlich mittels qRT-PCR verifiziert. Die auffälligsten Daten lieferten hierbei vor allem der komplementierte yggG Deletionsstamm, in dem alle Gene der Flagellensynthese stark herunterreguliert waren. Auch die funktionelle Analyse durch Schwärmassays zeigte, dass die Bakterien des komplementierten yggG Deletionsstamms nicht in der Lage sind zu schwärmen, was auf die fehlenden Flagellen zurückzuführen ist. Laut Ferrières und Clarke (2003) sowie Hagiwara et al. (2003) ist YggG Teil des Rcs-Regulons. Dies ist interessant, da über den Rcs-Weg, speziell über den Regulator RcsB, die Flagellensynthese negativ reguliert wird. Das liefert einen potentiellen Zusammenhang zwischen YggG dem Rcs-Weg und der Flagellensynthese. Aufgrund dieser Hinweise wurde YggG in einem rcsB Deletionsstamm überexprimiert und mit den Bakterien Schwärmassays durchgeführt. Die Bakterien waren wieder in der Lage zu schwärmen. Somit ist YggG indirekt an der Regulation der Flagellensynthese beteiligt. Die Charakterisierung der Metalloproteasen YfgC und YggG lieferten die ersten Hinweise bzgl. Ihrer Substratspezifität, des oligomeren Zustände sowie ihrer physiologischen Bedeutung in E. coli und bilden eine gute Basis zur weiteren Charakterisierung.

Dieser Eintrag ist freigegeben.