Mombour, Janne:

Ökophysiologische und phytopathische Unterschungen an Phytophtora alni -infizierten Schwarzerlen (Alnus glutinosa) [L.] Gaertn.) unter besonderer Berücksichtigung der Ausbreitungsdynamik des Pathogens im Rindergewebe

Duisburg, Essen (2009), 183 Bl.
Dissertation / Fach: Biologie
Fakultät für Biologie
Pfanz, Hardy (Doktorvater, Betreuerin)
Oßwald, Wolfgang (GutachterIn)
Duisburg, Essen, Univ., Diss., 2010
Abstract:
Ziel dieser Arbeit war zum einen die Identifizierung zellulärer Gene, die infolge der Expression der viralen Onkoproteine E6 und/oder E7 des humanen Papillomvirustyps 16 unter Langzeitkultivierungsbedingungen in humanen Keratinozyten ein verändertes Genexpressionsprofil aufweisen. Es konnten mittels Mikroarray-Analyse insgesamt 3434 zelluläre Gene ermittelt werden, die in HPV16 E6-, E7- bzw. E6/E7-positiven humanen Vorhautkeratinozyten gegenüber primären Kontrollzellen differenziell exprimiert waren. Hierzu zählen insbesondere Gene, deren Produkte an der zellulären Differenzierung, der Zellzyklusprogression, der Apoptose und der Immunantwort beteiligt sind. Das veränderte Genexpressionsmuster von 14 Genen, darunter DCN, LDOC1, RERG, THBS2, TWIST1, WT1 und WNT4 konnte mit Hilfe einer Real Time RT-PCR-Analyse verifiziert werden. Zudem konnte auch auf Proteinebene eine erhöhte Wnt4-Expression in HPV16 E6/E7-positiven Keratinozyten im Vergleich zu primären Kontrollzellen und HPV16 E6- bzw. E7-positiven Zellen in einer Western blot-Analyse nachgewiesen werden. Ein weiterer Schwerpunkt war die Etablierung eines in vitro Tumorprogressionsmodells sowohl für humane Vorhautkeratinozyten als auch humane Bronchialepithelzellen, um zu ermitteln, ob die gezielte Modulation p53-, Rb-, Telomerase-, Wachstumsfaktor- und PP2A-abhängiger Signalwege ausreicht, um in diesen Zelltypen eine maligne Transformation zu induzieren. Hierzu wurden verschiedene virale und zelluläre Onkogene mittels retroviraler Transfektion in die Zellen eingebracht. Für humane Vorhautkeratinozyten konnte gezeigt werden, dass die Expression der HPV16-Onkoproteine E6 und E7 eine verstärkte hTERT-mRNA-Expression bzw. Telomerase-Aktivität induziert. Diese Zellen besitzen jedoch auch nach Langzeitkultivierung keine tumorigenen Eigenschaften. Die kombinierte Expression von HPV16 E6/E7 und H-Ras und eine damit verbundene Erhöhung der c-Myc-Proteinexpression führt zwar zu einer verstärkten Kolonieformation in Softagar, befähigt diese Zellen nach subkutaner Injektion jedoch nicht zur Tumorbildung in immundefizienten Nacktmäusen. Eine zusätzliche Expression von SV40 st resultiert in HPV16 E6/E7- und H-Ras-positiven humanen Vorhautkeratinozyten in einem Wachstumsnachteil, dem die Zellen mit einem Abschalten der HPV16 E6/E7- oder SV40 st-Expression entgegenwirken. Keratinozyten, die nachweislich HPV16 E6/E7-negativ, aber H-Ras- und SV40 st-positiv waren, wiesen ein deutlich erhöhtes kolonienbildendes Potenzial auf. Für zwei Zelllinien konnte darüber hinaus in einem bzw. zwei von sechs Fällen eine Tumorentwicklung in immundefizienten Nacktmäusen nach subkutaner Injektion mit Matrigel detektiert werden. Für humane Bronchialepithelzellen konnte gezeigt werden, dass die kombinierte Expression von hTERT, SV40 LT und H-Ras eine mäßig ausgeprägte Fähigkeit zur Kolonieformation in Softagar induziert, welche durch eine zusätzliche Expression von SV40 st sichtlich gesteigert wird. Während hTERT-, SV40 LT- und H-Ras-positive Zellen keine Tumorentwicklung in vivo induzieren, konnte bisher für mindestens eine hTERT-, SV40 LT-, H-Ras- und SV40 st-positive humane Bronchialepithelzelllinie das Potenzial zur Tumorbildung in immundefizienten Nacktmäusen infolge einer subkutanen Injektion mit Matrigel in einem von sechs Fällen dokumentiert werden. Im Zusammenhang mit der Etablierung der beschriebenen in vitro Tumorprogressionsmodelle konnte zudem nachgewiesen werden, dass CIP2A nicht als PP2A-inhibierendes Element anstelle von SV40 st verwendet werden kann, da bereits immortalisierte Vorhautkeratinozyten und Bronchialepithelzellen eine deutliche CIP2A-mRNA- und Proteinexpression aufweisen. Allerdings konnte eine erhöhte CIP2A-Proteinexpression in immortalisierten und tumorigenen humanen Bronchial- bzw. Lungenepithelzellen detektiert werden. Erste immunhistochemische Analysen der CIP2A-Expression an Lungengewebe deuten auf eine mögliche Eignung von CIP2A als prognostischen Marker für Lungenkarzinome hin.