Die Serin-Protease HtrA1 ist ein neuer Regulator der Zellteilung und spielt eine wichtige Rolle in der malignen Transformation

Duisburg, Essen (2010), 113 Bl.
Dissertation / Fach: Biologie
ehem. Fakultät für Biologie und Geografie
Ehrmann, Michael (Doktorvater, Betreuerin)
Knauer, Shirley (GutachterIn)
Dissertation
Abstract:
Die humane Serinprotease HtrA1 gehört zur hochkonservierten Familie der HtrA-Proteine, deren Mitglieder in vielen verschiedenen Organismen nachgewiesen wurden. Die Mitglieder der HtrA-Familie werden dabei häufig mit der zellulären Stressantwort in Verbindung gebracht. Die humanen HtrAs weisen mit Ausnahme von HtrA2 große strukturelle Ähnlichkeiten auf. HtrA1 und HtrA3 wurden mit verschiedenen Tumorarten in Verbindung gebracht. HtrA1 wurde dabei vermehrt eine Rolle als Tumorsuppressor zugeschrieben und mit der malignen Transformation von Zellen in Verbindung gebracht. Intrazellulär kann HtrA1 an Mikrotubuli nachgewiesen werden. Diese Lokalisation bleibt auch während der Spindelbildung in der Mitose erhalten. In dieser Arbeit sollte die Auswirkung einer reduzierten HtrA1-Expression auf verschiedene Zellprozesse, die hinsichtlich einer Rolle als Tumorsuppressor und bei der malignen Transformation von Bedeutung sind, untersucht werden. Zunächst konnte gezeigt werden, dass die HtrA1-Expression in den verwendeten Modellsystemen reduziert ist. Außerdem ist HtrA1 sowohl extra- als auch intrazellulär lokalisiert, wenn auch die Lokalisation an Mikrotubuli mit dem verwendeten Antikörper nicht gezeigt werden konnte. Anschließend wurde der DNA-Gehalt der Zellen sowie das Zellteilungsverhalten von HtrA1-knockout-Fibroblasten untersucht. Dabei zeigten die Zellen nach einigen Passsagen eine deutliche Verschiebung des DNA-Gehalts von einem diploiden hin zu einem tetraploiden Chromosomensatz. Dieser wurde von einer erhöhten Centrosomenzahl und dem Vorkommen von multipolaren Spindeln begleitet. Es konnte in dieser Arbeit nicht geklärt werden, ob die Centrosomenanomalie eine Ursache oder eine Konsequenz der Tetraploidie ist. Allerdings sind sowohl die Tetraploidie als auch die erhöhte Anzahl an Centrosomen ein deutlicher Hinweis für eine chromosomale Instabilität und können Merkmal einer beginnenden malignen Transformation sein. Weitere Hinweise auf den Einfluss der reduzierten HtrA1-Expression auf die maligne Transformation gaben auch die Untersuchungen bezüglich Proliferationsverhalten und Zellgröße. Zellen ohne HtrA1 proliferieren schneller als Zellen mit intakter HtrA1-Expression und zeigen außerdem eine verlängerte Lebensdauer. Zusätzlich ist die Zellgröße verringert. Dies gibt Hinweise darauf, dass sich HtrA1-knockout-Zellen den normalen zellulären Kontrollmechanismen für Wachstum und Replikationspotential entziehen. Des Weiteren wurde das Migrationsverhalten der HtrA1-knockout-Fibroblasten untersucht. Dabei zeigte sich, dass in primären Zellen der Verlust der HtrA1-Expression zu einem verringerten Migrationsvermögen der Zellen führt. Dies steht allerdings im Widerspruch zu veröffentlichten Daten. Dieser Unterschied kann nur durch den genetischen Unterschied zwischen primären und bereits transformierten Zellen erklärt werden. Das verringerte Migrationsvermögen von HtrA1-knockout-Zellen widerspricht dem Phänotyp von transformierten Zellen. Auch in der Kolonkarzinomzelllinie SW480 wurde die Auswirkung des Verlusts der HtrA1-Expression untersucht. SW480-Zellen mit verminderter HtrA1-Expression zeigen ebenfalls eine ausgeprägte Verschiebung von einem diploiden hin zu einem tetraploiden Chromosomensatz. Diese Verschiebung ist allerdings abhängig von der Zelldichte. Dies gibt einen Hinweis darauf, dass HtrA1 ein extrazelluläres Sensormolekül für die Zelldichte sein könnte. Des Weiteren zeigte sich, dass die HtrA1-Expression einen Einfluss auf die Höhe der p21-, p53- und Mdm2-Expression hat. Daraus wurde ein Modell für die Regulation des p53-Signalwegs durch HtrA1 abgeleitet. Der proteolytische Abbau von Mdm2 durch HtrA1 erlaubt demnach eine Stabilisierung von p53 und damit die Transkription von p21. Zusätzlich wurde eine zellzyklusabhängige Regulation der HtrA1-Proteinmenge sowohl in primären Mausfibroblasten als auch in der Kolonkarzinomzelllinie SW480 gefunden. Dies legt eine Regulation der HtrA1-Proteinmenge durch Ubiquitinligasen nahe. Durch Induktion der zellulären Stressantwort und Untersuchung der daraus resultierenden differentiellen Genregulation mittels eines cDNA-Microarrays sollten Gene identifiziert werden, die ein ähnliches Expressionsmuster wie HtrA1 zeigen. Aus den bekannten Regulationsmechanismen dieser Gene soll dann auf mögliche Regulationswege von HtrA1 geschlossen werden. Ein aussichtsreicher Kandidat hierfür ist Cyclin D1, da einige der Transkriptionsfaktoren, die die Cyclin D1-Expression induzieren, auch Bindungsstellen im möglichen HtrA1-Promotor aufweisen.

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