Abstract:

Hox-Gene spielen bei der Gliedmaßenentwicklung eine entscheidende Rolle, da sie durch ihre überlappenden Expressionsdomänen die Identität der einzelnen Knochen definieren. Für die Bildung von Ulna und Radius sind Hoxa11 und Hoxd11 essentiell, wie die erhebliche Reduktion dieser Knochen in Hoxa11-/-;Hoxd11-/--Mausmutanten beweist (Boulet und Capecchi, 2004; Davis et al., 1995). Neben dem Einfluss von Hox-Genen auf die Identität der Gliedmaßenelemente wurden in Hoxa11-/-;Hoxd11-/--Embryonen Hinweise auf eine Funktion der Hox-Gene während der Chondrozytendifferenzierung gefunden (Boulet und Capecchi, 2004). Der Einfluss von Hoxa11 und Hoxd11 auf die Chondrozytendifferenzierung sollte im Rahmen dieser Arbeit mit Hilfe der Vorderextremitäten von Hoxa11-/-;Hoxd11-/--Mausmutanten im Detail analysiert werden. Da nach Mendel die Wahrscheinlichkeit in einem Wurf einen Hoxa11-/-;Hoxd11-/--Embryo zu bekommen nur 6,25% beträgt, wurden zusätzlich die Vorderextremitäten von Mäusen mit der dominanten Ulnaless-Mutation untersucht, die in einem Wurf 50% Ulnaless-Embryonen erzeugen. Die Ulnaless-Mäuse dienten als Modell der Hoxa11-/-;Hoxd11-/--Mutation, da im Zeugopod dieser Mäuse die Funktion von Hoxa11 und Hoxd11 durch ektopische Expression posteriorer Hox-Gene reprimiert ist und sie deshalb einen ähnlichen Phänotyp der Vordergliedmaßen wie Hoxa11-/-;Hoxd11-/--Mutanten besitzen. Der Vergleich der Chondrozytendifferenzierung in den Vordergliedmaßen von Hoxa11-/-;Hoxd11-/-- und Ulnaless-Mutanten ergab, dass nur die Ulna der Ulnaless-Embryonen durch die ektopische Expression von Hoxd12 und Hoxd13 beeinflusst ist und somit als Modell der Hoxa11-/-;Hoxd11-/--Mutation dienen kann. Beide Mauslinien weisen im Zeugopod am Tag E14.5 und E16.5 sowohl auf morphologischer als auch molekularer Ebene eine Inhibition der Chondrozytendifferenzierung auf. Es wurden hauptsächlich Chondrozyten eines frühen Differenzierungsstadiums in Ulna und Radius der Mutanten detektiert. In späteren Embryonalstadien wurden jedoch auch kolumnare und hypertrophe Chondrozyten im Zeugopod der Mutanten nachgewiesen, so dass man insgesamt von einer erheblich verzögerten, hypertrophen Differenzierung der Chondrozyten sprechen muss. Weiterhin wurde eine veränderte Lokalisation der kolumnaren und hypertrophen Chondrozyten in den Gliedmaßen der Hoxa11-/-;Hoxd11-/-- und Ulnaless-Mutanten beobachtet, die ein Indiz für die Funktion von Hoxa11 und Hoxd11 in der Anordnung der Chondrozyten in der Wachstumsfuge ist. Hoxa11 und Hoxd11 sind demnach notwendig, um eine exakte, zeitliche und räumliche Abfolge der Chondrozytendifferenzierung in Ulna und Radius zu ermöglichen. Obwohl die Chondrozytendifferenzierung in der Ulna von Ulnaless-Gliedmaßen mit der Differenzierung der Chondrozyten in Ulna und Radius von Hoxa11-/-;Hoxd11-/--Extremitäten vergleichbar ist, so wurden doch auch Unterschiede zwischen den Vordergliedmaßen dieser beiden Mauslinien gefunden. Durch die Analyse von postnatalen Ulnaless-Vorderextremitäten wurde offensichtlich, dass in Ulnaless-Mutanten nur das Olecranon vorhanden ist. Demnach sind Hoxa11 und Hoxd11 auch für die Bildung der distalen Ulna verantwortlich. Durch die molekulare Analyse der Vorderextremitäten beider Mauslinien wurde Shox2 als potentielles Zielgen von Hoxa11 und Hoxd11 detektiert. Ob diese posterioren Hox-Gene Shox2 aktivieren können und dadurch die hypertrophe Differenzierung der Chondrozyten induziert wird, soll in weiteren Experimenten durch Analyse des Shox2-Promotors und durch Überexpression von Shox2 in Ulnaless-Gliedmaßen geklärt werden. Des Weiteren wurde eine Analyse des Ihh-Promotors durchgeführt, um zu verstehen, wie Ihh während der Chondrozytendifferenzierung reguliert wird. Es wurden konservierte Bereiche im genomischen 5’Bereich von Ihh nachgewiesen und auf Enhancer-Aktivität in vitro und in vivo getestet. In vivo konnte keine Enhancer-Aktivität der untersuchten, genomischen Sequenzen ermittelt werden. Vermutlich sind längere Fragmente oder weiter entfernte Sequenzen notwendig, um die Expression von Ihh in den Gliedmaßen zu regulieren. In vitro wurde dagegen das T1-Fragment als Ihh-Enhancer identifiziert. Als Aktivatoren der Ihh-Expression wurden die Homöobox-Transkriptionsfaktoren SHOX und SHOX2 detektiert. Eine Repression erfolgte in vitro durch BMP2 sowie mit HOXA9, Hoxa11 und Hoxd11. Als weiterer, putativer Aktivator von Ihh wurde MMP3 in einem Hefe-Ein-Hybrid System identifiziert. Zur Bestätigung der Regulation der Ihh-Expression durch MMP3 sind elektrophoretische Mobilitätstests oder Luciferase-Assays notwendig. Insgesamt konnten durch diese Promotor-Analyse neue Regulatoren von Ihh und somit der hypertrophen Differenzierung der Chondrozyten ermittelt werden.