Tennstädt, Annette:

Die protektive Rolle der konservierten Serinprotease HTrA1 in der Alzheimerschen Krankheit

Duisburg, Essen (2009), XIII, 161 S.
Dissertation / Fach: Biologie
Fakultät für Biologie » Mikrobiologie
Nalbant, Perihan (Doktorvater, Betreuerin)
Ehrmann, Michael; Bayer, Peter (GutachterIn)
Dissertation
Abstract:
Die Pathogenese der Alzheimerschen Erkrankung (AD) hängt maßgeblich von der Anreicherung intrazellulärer und extrazellulärer Protein-Ablagerungen ab. Der Hauptbestandteil der intrazellulären Ablagerungen ist das hyperphosphorylierte tau-Protein und die extrazellulären Ablagerungen werden hauptsächlich aus den Aβ-Peptiden gebildet. In der Literatur sind einige Proteasen beschrieben, die das Aβ-Peptid und seine Ablagerungen abbauen können. Interessanterweise konnte eine gleichwertige tau Protease nicht identifiziert werden.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Rolle der konservierten Serinprotease HtrA1 bei AD analysiert. Im ersten Teil wurde mit Hilfe von biochemischen Methoden gezeigt, dass HtrA1 in der Lage ist lösliche tau-Varianten abzubauen. Dabei hatte die Phosphorylierung bzw. Pseudohyperphosphorylierung des tau-Proteins auf die enzymatische Aktivität von HtrA1 keinen relevanten Effekt. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass die entstandenen tau-Fragmente ihre Fähigkeit zur Aggregation verloren hatten, da die Regionen die maßgeblich an der Aggregation beteiligt sind, vollständig von HtrA1 abgebaut wurden. Außerdem wurde aus Gehirnen von AD Patienten tau-Ablagerungen (größer als 1 MDA) isoliert. Bemerkenswerterweise konnte HtrA1 auch diese Ablagerungen abbauen, wodurch HtrA1 als wirksame tau Protease ausgezeichnet wird.
Es wurde ebenfalls untersucht, ob HtrA1 in vivo in der Lage ist tau abzubauen. Hierfür wurde in PC12 Zellen mittels Western-Blot gezeigt, dass eine Überexpression von HtrA1 eine starke Reduktion der wt-tau- und der pseudohyperphosphorylierten-tau-Proteinmenge zur Folge hatte.
In weiterführenden zellbiologischen Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass eine erhöhte intrazelluläre Menge an tau zu einer erhöhten Expression des HTRA1-Gens führte. Dabei hatte die Pseudohyperphosphorylierung des tau-Proteins einen additiven Effekt auf die HtrA1-RNA-Expression. Wurde die tau-Menge dagegen extrazellulär erhöht, führte dies zu keiner erhöhten HtrA1-RNA-Expression aber zu einem Anstieg der extrazellulären HtrA1-Proteinmenge. Somit scheinen erhöhte tau-Mengen zu einer bisher unbekannten zellulären Stressantwort zu führen an welcher HtrA1 beteiligt zu sein scheint.


Mit Hilfe der konfokalen Laser-Raster-Mikroskopie wurde in U373-MG Zellen die subzelluläre Lokalisation von HtrA1 untersucht. Es konnte eine Lokalisation von HtrA1 am Mikrotubuli-Netzwerk und zusätzlich eine Kolokalisation mit tau nachgewiesen werden.
In Gehirngewebe von AD Patienten korrelierte eine erhöhte HtrA1-Proteinmenge signifikant mit einer verminderten Anreicherung des nativen und hyperphosphorylierten tau-Proteins. Bei den Kontrollen konnte dieser Effekt nicht beobachtet werden. Anhand dieser Ergebnisse kann die Hypothese aufgestellt werden, dass HtrA1 ein Teil der Protein-Qualitätskontrolle bei AD ist.
Kürzlich wurde ein einzelner Nukleotid Polymorphismus im HTRA1-Promotor als genetischer Risikofaktor für die altersbedingte Makuladegeneration (AMD) beschrieben (Dewan et al., 2006; Yang et al., 2006). Aufgrund pathophysiologischer Gemeinsamkeiten von AMD und AD, wurde in dieser Arbeit auch die mögliche funktionelle Bedeutung des Polymorphismus bei AD untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass der Polymorphismus keinen Einfluss auf die Expression von HtrA1 hatte und demzufolge kein Risikofaktor für AD darstellt.
Die Arbeiten von Grau et al. haben HtrA1 als Aβ Protease charakterisiert (Grau et al., 2005). Um zu zeigen, dass die Funktion von HtrA1 auch in vivo relevant ist, wurde die Aβ-Peptidmenge in tg2576 Mäusen und in tg2576 x HtrA1 knockout Mäusen analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass der knockout von HtrA1 eine Anreicherung des Aβ42-Peptids bzw. des Aβ40-Peptids in Gehirngewebe zur Folge hatte. Somit konnte die Relevanz von HtrA1 auch im AD-Mausmodell gezeigt werden.
AD ist bis heute nicht heilbar. Die Etablierung von effizienten Therapiestrategien ist notwendig, um die Prognose der Erkrankten zu verbessern. Ein möglicher Therapieansatz ist der Abbau der pathologischen Ablagerungen durch Proteasen. Eine gezielte Erhöhung der proteolytischen Aktivität einer geeigneten Protease könnte als Strategie für neue Verfahren verwendet werden. In dieser Arbeit wurde HtrA1 als wirksame tau und Aβ Protease beschrieben, dadurch rückt HtrA1 in den Fokus für neue Therapiestrategien.

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