Mamant, Nicolette:

Charakterisierung des Aktivierungsmechanismus der HtrA-Protease DegP von E. coli

Duisburg, Essen (2009), 170 Bl.
Dissertation / Fach: Biologie
Fakultät für Biologie » Mikrobiologie
Ehrmann, Michael (Doktorvater, Betreuerin)
Siebers, Bettina; Groot, Herbert de (GutachterIn)
Dissertation
Abstract:
Das periplasmatische Hitzeschockprotein DegP spielt eine entscheidende Rolle in der bakteriellen Proteinqualitätskontrolle und besitzt eine Doppelfunktion als Protease und Chaperon. Es gehört zu der konservierten Familie der HtrA-Proteasen, deren Mitglieder eine katalytische Serinproteasedomäne mit mindestens einer PDZ-Domäne kombinieren und wichtige physiologische Funktionen in lebenden Zellen einnehmen. DegP wird in seiner Proteaseaktivität temperaturabhängig und allosterisch aktiviert. Der allosterische Mechanismus dominiert dabei die temperaturabhängige Aktivierung und geht einher mit einer Verschiebung des oligomeren Zustandes vom hexameren Ruhezustand zu proteolytisch aktiven 12 und 24meren Partikeln. Während diese Erkenntnisse primär auf strukturellen Daten basieren, ist der zugrunde liegende Mechanismus bisher nicht vollständig geklärt. Ziel dieser Arbeit war es daher, neue mechanistische Einblicke in die DegP-Aktivierung und Oligomerisierung zu gewinnen. Dazu wurden Mutationsanalysen mit Enzymtests, in vivo Komplementationstests, Oligomerisierungs- und Bindungsstudien sowie massenspektrometrischen Untersuchungen kombiniert. Der Fokus wurde dabei insbesondere auf die PDZ1- Domäne gerichtet. Darüber hinaus wurden die Loops L3 und L2 der Proteasedomäne genauer untersucht. Die Ergebnisse der Analysen bestätigten den postulierten Zusammenhang der Aktivierung und Oligomerisierung und resultierten in einem möglichen mechanistischen Modell der DegP-Regulation. Es wurde gezeigt, dass 7mere und 10mere Peptide im Zuge der Aktivierung spezifisch an die PDZ1-Domäne binden und strukturelle Umorientierungen in der Proteasedomäne induzieren. Dabei findet eine Kommunikation zwischen den Elementen PDZ1, Loop L3, Loop LD und Loop L2 statt, die letztendlich zu der Ausbildung eines intakten aktiven Zentrums führt. Die aktive Form des Proteins assembliert zu 12 und 24meren Homooligomeren, die einen Innenraum für die hoch effiziente Degradation des Proteinsubstrats zur Verfügung stellen. Mittels Bindungsstudien wurde in diesem Zusammenhang eine direkte Korrelation zwischen der Stärke der Peptidbindung und dem Grad der DegP-Aktivierung und Oligomerisierung gezeigt. Außerdem wurde gezeigt, dass die PDZ1-Domäne eine essentielle Rolle für die enzymatische Aktivität, die Aktivierung und die Oligomerisierung einnimmt. Im Weiteren konnte die Hypothese aufgestellt werden, dass die PDZ1-Domäne und das aktive Zentrum ähnliche Sequenzspezifitäten besitzen, was eine prozessive Hydrolyse der DegP-Substrate ermöglicht, bei der die PDZ1- und Proteasedomäne miteinander kooperieren. Darüber hinaus gaben die Analysen der Loops L3 und L2 Aufschluss über die bedeutsame Rolle dieser Elemente für die proteolytische Aktivität, die Aktivierung und die Oligomerisierung. Mit dem in dieser Arbeit aufgestellten mechanistischen Modell wurde ebenfalls zu der Klärung der Frage beigetragen, wie DegP zwischen reparierbaren und degradierbaren Substraten unterscheidet. Demnach bestimmen Substrate ihr Schicksal selbst mit, indem sie die Faltung des Hexamers und der höheren aktiven Oligomere selbst initiieren und DegP auf diese Weise allosterisch aktivieren. Während ungefaltete Proteine prozessiv degradiert werden, werden gefaltete Moleküle vermutlich im Innenraum des aktiven DegP vor der Proteolyse geschützt und reparierbare Proteine in der Rückfaltung unterstützt. In einem weiteren Schritt dieser Arbeit wurden neue DegP-Aktivatoren identifiziert. Dabei handelte es sich zum einen um den Aktivator DPMFKLV, der im Verlauf der Arbeit bereits erfolgreich für die Aufklärung des Aktivierungsmechanismus eingesetzt wurde. Das Screening einer E. coli Peptidbibliothek führte zum anderen zu der Identifizierung der zwei Aktivatorpeptide CHHSAFPVFL und DYFGSALLRV, die die C-Termini zweier E. coli Zellhüllproteine darstellen. Die Erkenntnisse dieser Arbeit können zukünfig zu der Aufklärung der Regulationsmechanismen anderer HtrA-Proteasen beitragen. Von medizinischem Interesse ist in diesem Zusammenhang zum Beispiel das humane HtrA1, dem eine Rolle in der Tumorentstehung und Progression sowie in Proteinfaltungskrankheiten wie Arthritis, Morbus Parkinson und der Alzheimerschen Krankheit zugesprochen wird.