Hülsmann, Bärbel:

Untersuchungen zu regulatorischen T-Zellen (Treg) beim Multipen Myelom

Duisburg, Essen (2010), X, 139 Bl.
Dissertation / Fach: Biologie; Medizin
Fakultät für Biologie
Medizinische Fakultät
Opalka, Bertram (Doktorvater, Betreuerin)
Dittmer, Ulf (GutachterIn)
Duisburg, Essen, Univ., Diss., 2010
Abstract:
Treg gewinnen in der Medizin immer mehr an Bedeutung. Insbesondere, da sie einen negativen Einfluss auf das Ergebnis verschiedener Therapieansätze, wie beispielsweise einer Immuntherapie haben können, ist es von großem medizinischem Interesse, diese Population zu erforschen und gegebenenfalls zu manipulieren. In der vorliegenden Arbeit sollte die Rolle der Treg bei MM-Patienten untersucht werden. Hierzu mussten zunächst durchflußzytometrische Protokolle erstellt werden, mit deren Hilfe Treg in Blutproben und Knochenmarkproben identifiziert werden konnten. Die Identifikation der Treg erfolgte hierbei mittels einer Kombination der Treg-spezifischen Oberflächenmarker: CD4+, CD25high, CD62L+, CTLA-4+, CD45RO+, CD45RA+, CD27+ und CD127low. Es ergab sich eine 70,8%ige bis 97,4%ige Positivität für die verwendeten Marker. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass die hier untersuchten Treg eher dem „Memory“-Phänotyp als dem naiven Phänotyp entsprachen.
Im weiteren Verlauf der Arbeit wurden Blutproben von 11 normalen Spender und 13 Bronchialkarzinompatienten, sowie Blut- und Knochenmarkproben von 42 MM-Patienten miteinander bezüglich der relativen und absoluten Treg-Zahlen verglichen. Die Patienten wurden hierfür in Gruppen eingeteilt, um den Einfluss verschiedener Krankheitsparameter und der Therapie auf die Treg-Zahlen sichtbar zu machen. Die Ergebnisse zeigten nur dann eine erhöhte prozentuale Treg-Zahl im peripheren Blut von MM-Patienten gegenüber normalen Spendern, wenn sowohl therapierte, als auch unbehandelte MM-Patienten in einer Gruppe zusammengefasst wurden, was auf einen möglichen Einfluss der Therapie hindeutet. Die Ergebnisse für den Vergleich von untherapierten Patienten mit CTX-Patienten bestätigten diese Vermutung, da gegenüber den unbehandelten Patienten in den Gruppen mit CTX erhöhte Treg-Frequenzen nachgewiesen werden konnten. Eine Einteilung der Patienten bezüglich verschiedener Krankheitsparameter ergab hingegen keine signifikanten Unterschiede in den Treg-Werten.
Auch die Auswertugen der Treg-Zahlen im Knochenmark zeigten keinen direkten Einfluß der Krankheit auf die Treg-Werte.
Der Vergleich von BK- und MM-Patienten ergab wie erwartet eine signifikant höhere Treg-Frequenz bei BK-Patienten im Vergleich zu normalen Spendern und MM-Patienten. Die in der Literatur beschriebene Erhöhung der Treg-Frequenz bei soliden Tumoren konnte also bestätigt werden.
Zusätzlich zu den beschriebenen Analysen wurden auch Treg-Zahlen bei zwei Patienten vor, während und nach einer Immuntherapie gemessen. Hierbei konnte gezeigt werden, dass bei beiden Patienten ein kontinuierlicher Anstieg der prozentualen und absoluten Treg-Zahlen zu sehen ist. Dies weist auf eine Erhöhung der Treg bedingt durch die Immuntherapie hin.
Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit der Isolierung, Expansion und mit funktionellen Tests von Treg normaler Spender. Bei der Analyse verschiedener Isoliermethoden, basierend auf magnetischen Beads oder einem FACS, erwies sich diejenige Treg-Aufreinigung als am besten geeignet, die ausschließlich ein FACS verwendet und auf eine Voraufreinigung mittels magnetischer Beads verzichtet. Aufreinigungen durch magnetische Beads ergaben nur sehr geringe Ausbeuten und wurden deshalb als nicht geeignet eingestuft.
Bei In-vitro-Expansionen zuvor isolierter Zellen konnte zwar eine Vermehrung der Treg-Fraktion um den Faktor 10 erreicht werden, eine FOXP3-Färbung nach Expansion zeigte allerdings nur eine Positivität der Treg-Fraktion von 9,5%. Somit konnte gezeigt werden, dass eine große Reinheit der Treg-Fraktion von entscheidender Bedeutung für die erfolgreiche Treg-Expansion ist, um die Problematik des Überwachsens durch andere in der Treg-Fraktion verbliebene Zellen zu minimieren. Auch die in dieser Arbeit durchgeführten Suppressionstests zeigten eine deutlichere Suppression durch Treg bei Verwendung von zuvor nicht expandierten Zellen.

Die vorliegende Arbeit gibt demnach Hinweise auf eine Beeinflussung der Treg-Zahlen bei MM-Patienten sowohl durch die Chemotherapie als auch durch die Immuntherapie. Im Gegensatz zu den Ergebnissen für BK-Patienten konnten für MM-Patienten keine Ergebnisse erzielt werden, die auf einen direkten Einfluss der Krankheit auf Treg schließen lassen. Somit wäre eine weitere Analyse der Reaktion der Treg auf verschiedene Therapien von klinischer Bedeutung, da so eine mögliche negative Beeinflussung der Treg auf den Therapieerfolg verhindert werden kann. Des Weiteren könnten die Mechanismen, mit deren Hilfe Treg resistent gegen konventionelle Chemotherapien werden bzw. schneller als andere CD4-positive Zellen rekonstituieren von medizinischer Bedeutung sein.