Lehmberg, Kai Sven:

Resistenz humaner hämatopoetischer Zellen gegenüber Cytarabin nach retroviral vermitteltem Transfer des Cytidindeaminase-Gens

Duisburg, Essen, Univ. (2010), 90 Bl.
Dissertation / Fach: Medizin
Medizinische Fakultät » Universitätsklinikum Essen » Innere Klinik (Tumorforschung)
Flaßhove, Michael (Doktorvater, Betreuerin)
Schütt, Philipp (GutachterIn)
Dissertation
Abstract:
Hintergrund: Die Cytidindeaminase (CDD) detoxifiziert intrazellulär Cytarabin (Cytosin-Arabinosid). Überexpression des Enzyms in hämatopoetischen Zellen führt zu Resistenz gegenüber Cytarabin. Dies konnte bisher durch retroviralen CDD-Transfer in vitro für humane hämatopoetische Zelllinien sowie murine primäre hämatopoetische Zellen gezeigt werden. Mögliche klinische Anwendungen sind die Reduktion der Myelosuppression nach Cytarabin-Applikation oder die Verwendung als selektierbarer Marker.
Methoden: Mit einem Vektor, der CDD und das enhanced green fluorescent protein (EGFP) trug, wurde durch Lipofektion eine transiente Produzentenzelllinie erzeugt. Mit deren Überstand wurde eine stabile Produzentenzellpopulation generiert, aus der mit Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung und Bestimmung des retroviralen Titers ein hoch EGFP-exprimierender Einzellklon identifiziert wurde. CD34+-Zellen aus humanem Nabelschnurblut wurden mit Zytokinen prästimuliert und durch Kultur im Überstand des Einzelzellklones transduziert. In Koloniebildungs-Versuchen in einer Verdünnungsreihe von Cytarabin wurde die Resistenz der CD34+-Zellen mit einer Kontrollpopulation verglichen, die mit einem EGFP-haltigen Vektor ohne CDD transduziert worden war. Das Wachstum von colony forming units – in culture (CFU-C) wurde als Maß der Protektion verwendet. Einzeln analysiert wurden die Untergruppen CFU - granuloyte/macrophage (CFU-GM) und burst forming units – erythrocyte (BFU-E) als Repräsentanten des myeloischen Kompartiments bzw. des erythropoetischen Kompartimentes. Durch PCR und Southern blot wurde der Nachweis proviraler DNA in den CFU geführt.
Ergebnisse: Die Transduktionsrate in den CD34+-Zellen betrug 28 ± 2% (Standardabweichung des Mittelwertes SEM, n=4). Bei Konzentrationen von 20 – 100 nM war das Wachstum von CDD-transduzierten CFU-C signifikant höher, die inhibitorische Cytarabin-Dosis 50 lag mit 49nM ± 9 versus 27 ± 6 (SEM, n=6)) signifikant höher (n=6). Der protektive Effekt war bei BFU-E ausgeprägter als bei CFU-GM.
Schlussfolgerung: In dieser Arbeit konnte das erste Mal in humanen primären CD34+-Zellen durch retroviralen CDD-Gentransfer vermittelte Resistenz gegenüber Cytarabin nachgewiesen werden. Experimente im murinen Modell haben inzwischen die Anwendbarkeit des Verfahrens in vivo gezeigt.

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