Ahmed, Hatim:

The branched Entner-Doudoroff pathway in hyperthermophilic archaea

Duisburg, Essen (2006), V, 100 Bl.
Dissertation / Fach: Biologie
ehem. Fakultät für Biologie und Geografie
Siebers, Bettina (Doktorvater, Betreuerin)
Bayer, Peter (GutachterIn)
Dissertation
Abstract:
Vergleichende Studien der Glykolyse in hyperthermophilen Archaeen haben eine Vielzahl an Variationen der klassischen bakteriellen und eukaryontischen Wege offen gelegt, namentlich des Entner-Doudoroff (ED) Weg und des Embden-Meyerhof-Parnas (EMP) Weg. Während im aeroben Sulfolobus solfataricus der ED Weg die einzige Option für den Glukose Katabolismus darstellt, nutzt der anaerobe Thermoproteus tenax neben diesem zusätzlich einen reversiblen EMP Weg. Es wurden bislang zwei Modifikationen des ED Weg identifiziert, (i) der semi-phosphorylative (sp) ED Weg für halophile Archaea und (ii) der nicht-phosphorylative (np) ED Weg in thermophilen und hyperthermophilen Archaea. Durch einen Ansatz, basierend auf vergleichender Genomanalyse wurde ein ED Gencluster in den Genomen von T. tenax und S. solfataricus ausgemacht, was die Präsenz des sp ED Weg in diesen Organismen nahe legt. Das ED Gencluster umfasst Gene (i) einer putativen Glukonat Dehydratase (gad), (ii) einer 2-Keto-3-deoxy-glukonat Aldolase (kdgA), welche zuvor in S. solfataricus charakterisiert wurde [BUCHANAN et al., 1999], (iii) einer Zucker (KDG) Kinase, (iv) in T. tenax einer Glukan-1,4-α-Glukosidase (gaa gene) und (v) in S. solfataricus einer nicht phosphorylierenden Glycerinaldehyd-3-phosphat Dehydrogenase (GAPN, gapN). Northern Blot und Primer Extension zeigten eine koordinierte Transkription der für die Synthese und Degradation von 2-Keto-3-deoxy-glukonat (KDG) und 2-Keto-3-deoxy-6-phosphoglukonat (KDPG) kodierenden ED Gene. In T. tenax verfügt das ED Gencluster über ein gad Gen und das kdgA-kdgK-gaa Operon und in S. solfataricus findet sich ein gad-kdgA-kdgK Operon und das gapN Gen. Um die vorhergesagten Enzymaktivitäten zu bestätigen, wurden die entsprechenden Gene kloniert (für S. solfataricus geschah die Klonierung in Zusammenarbeit mit Prof. Dr. John van der Oost, Universität Wageningen, Niederlande), rekombinant exprimiert und für die Bestimmung der Enzymaktivitäten gereinigt bzw. angereichert. Zusammenfassend offenbart diese Arbeit (i) einen neuen Typ der Glukonat Dehydratase, (ii) eine bifunktionale 2-Keto-3-deoxy-(6-phospho)-glukonat Aldolase, (iii) eine 2-Keto-3-deoxy-glukonat Kinase und (iv) in S. solfataricus eine nicht phosphorylierende Glycerinaldehyd-3-phosphat Dehydrogenase (GAPN). Die Glukonat Dehydratase (GAD) katalysiert die Dehydratation von Glukonat zu KDG. Obwohl die GAD aus verschiedenen bakteriellen Quellen gereinigt und charakterisiert wurde, war das kodierende Gen nie zuvor identifiziert worden und stellt damit ein fehlendes Schlüsselelement im zentralen Kohlenhydratmetabolismus dar. Für T. tenax wurde die entsprechende Enzymspezifität mit Glukonat nachgewiesen, wohingegen für das Enzym aus S. solfataricus zusätzliche Aktivität mit Galaktonat nachgewiesen werden konnte [LAMBLE et al., 2004] Entgegen vorangehenden Studien der KDG Aldolase aus S. solfataricus [LAMBLE et al., 2003; HENDRY, et al., 2000], wurde sowohl für dieses Enzym, als auch für das Enzym aus T. tenax, Aktivität nicht nur mit den nicht-phosphorylierten Substraten, sondern auch mit den phosphorylierten Substraten, nachgewisen. Demnach ist das Enzym eine echte bifunktionale KD(P)G Aldolase und katalysiert die reversible Spaltung von KDG und KDPG. Für das Enzym aus S. solfataricus konnte gezeigt werden, dass es unspezifisch für KDG/KDPG und 2-Keto-3-Desoxygalaktonat/2-Keto-3-Desoxy-6-Phosphogalaktonat (KDGal/KDPGal) ist [LAMBLE et al., 2005; THEODOSSIS et al., 2004; LAMBLE et al., 2003]. Bislang gibt es noch keine Information über die Stereoselektivität für das Enzym aus T. tenax. KDG Kinase vermittelt die ATP abhängige Phosphorylierung von KDG zu KDPG und stellt somit ein Schlüsselenzym für den sp ED Weg dar. Für das Substrat KDG folgt das Enzym der Michaelis-Menten Kinetik. Das Enzym aus T. tenax ist damit die erste identifizierte und charakterisierte archaeale KDG kinase. Die Aktivität der nicht phosphorylierenden Glycerinaldehyd-3-phosphat Dehydrogenase (GAPN) aus S. solfataricus wurde mittels eines kontinuierlichen Tests bestimmt, indem die Bildung von NADPH oder NADH gemessen wurde. Das Enzym folgt der Michaelis Menten Kinetik für NADP+ und DL-GAP. In Gegenwart von NAD+ zeigte sich lediglich eine geringe Aktivität. Außerdem weist das Enzym allosterische Eigenschaften auf, wobei für Glukose 1-phosphat der größte Effekt beobachtet wurde. Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass sowohl die enzymatischen Studien, als auch die in vivo Identifizierung von Enzymaktivitäten in Rohextrakten, sowie Experimente zur in vitro Rekonstruktion, die Präsenz des semi-phosphorylativen ED Weg und des nicht-phosphorylativen ED Weg und damit eines verzweigten ED Weg in T. tenax und S. solfataricus belegen. Verfügbare Genomdaten, ebenso wie biochemische Daten zeigen darüber hinaus die Anwesenheit des verzweigten ED Wege in thermophilen Mitgliedern der Thermoproteales (T. acidophilum, T. volcanium, P. torridus und F. acidiphilum). Folglich stellt der verzweigte ED Weg die ED Modifikation in thermophilen und hyperthermophilen Archaea dar. Darüber hinaus legen BLAST Analysen eine noch weit größere Verbreitung dieses archaealen Typs der ED-ähnlichen Pfade auch bei den Bacteria und Eukarya nahe und helfen daher Komplexität und Flexibilität des zentralen Kohlenhydratmetabolismus in allen drei Domänen des Lebens zu entschlüsseln.