Siepen, Marc aus dem:

Die Bedeutung des NS5A-Proteins des Hepatitis C Virus für die Resistenz gegen Inerferon-alpha und Ribavirin

Duisburg, Essen (2006), V, 93 Bl.
Dissertation / Fach: Biologie
Fakultät für Biologie
Roggendorf, Michael (Doktorvater, Betreuerin)
Esche, Helmut; Küppers, Ralf (GutachterIn)
Dissertation
Abstract:
Seit kurzem ist es möglich das Hepatitis C Virus in Zellkulturen zu vermehren. Verschiedene Studien haben gezeigt, dass Interferon-α die Replikation des Virus´ in vitro effektiv hemmen kann. Dennoch sprechen in vivo nicht alle Patienten, die mit dem HCV infiziert sind, auf eine Therapie mit IFN-α in Kombination mit Ribavirin an. Dabei ist unklar, ob Wirts- oder Virusfaktoren für diese Art der Resistenz verantwortlich sind. Ein potentieller viraler Faktor, für den ein Einfluss auf den Therapieerfolg postuliert wurde, ist das HCV-Protein NS5A. Um diese Hypothese auf molekularer Ebene zu prüfen, wurde in der vorliegenden Arbeit ein neuartiger methodischer Ansatz gewählt. Dazu standen Seren von acht Patienten zur Verfügung, die mit dem gleichen Isolat des HCV-Stammes AD78 infiziert worden waren. Diese Patienten waren nach Interferon/Ribavirin-Kombinationstherapie zur Hälfte Responder und zur anderen Hälfte Nonresponder. Um Eigenschaften der NS5A-Proteine in Zellkultur untersuchen zu können, wurden die NS5A-Sequenzen aus den Patientenseren amplifiziert und in ein subgenomisches HCV-Replikon auf Basis des HCV-Stammes Con1 kloniert, das autonom in HuH7-Zellen repliziert. So entstanden chimäre Replikons mit eng verwandten NS5A-Sequenzen des Stammes AD78 im Kontext der nichtstrukturellen HCV-Proteine des Stammes Con1. Wenn das NS5A-Protein der virale Faktor wäre, der in vivo zur Resistenz des HCV gegen IFN-α führt, sollten die Replikons mit NS5A-Fragmenten aus Isolaten von Nonrespondern auch in vitro resistent sein. Das Replikonsystem bot gegenüber Systemen, bei denen einzelne HCV-Proteine in Zellen überexprimiert werden, den Vorteil, dass die nichtstrukturellen HCV-Proteine in physiologischeren Konzentrationen exprimiert wurden und ihre Funktionen im Komplex miteinander erfüllen konnten, so dass eine natürliche Infektion widergespiegelt wurde. Im Replikon war ein Neomycinphospho-transferasegen enthalten, mit dessen Hilfe Zellen selektiert wurden, die die Replikation unterstützten. Sechs der acht Replikonkonstrukte replizierten in HuH7-Zellen und sowohl HCV-RNAs als auch die viralen NS5A-Proteine konnten in den Zellen nachgewiesen werden. Um die Resistenz der Replikons gegen IFN-α zu bestimmen, wurden die etablierten Zelllinien mit IFN-α behandelt und der Einfluss auf die Replikation durch Messung der intrazellulären HCV-RNA-Mengen bestimmt. Es wurde jedoch eine konzentrationsabhängige Inhibition der Replikation aller Replikons ohne einen signifikanten Unterschied zwischen solchen mit NS5A-Fragmenten aus Responder- oder Nonresponder-Patienten beobachtet. Diese Ergebnisse zeigen, dass das NS5A-Protein nicht der virale Faktor ist, der zur Resistenz des HCV gegen IFN-α führt. In einem entsprechenden Ansatz wurde die Resistenz der Replikons gegen Ribavirin bestimmt und auch hier wurde eine Inhibition der Replikation aller HCV-RNAs ohne signifikante Unterschiede festgestellt. Im zweiten Teil der Arbeit wurde der Frage nachgegangen, ob man in vitro IFN-resistente Varianten der Replikons generieren kann und welche Mutationen zu einer solchen Resistenz beitragen. Dazu wurden die transfizierten Zelllinien für einen Zeitraum von mehreren Wochen mit unterschiedlichen IFN-Konzentrationen behandelt. Tatsächlich waren einige Zelllinien bei gleichzeitiger Selektion für die Replikon-RNA in der Lage, auch unter hohen IFN-Konzentrationen zu überleben. Es wurde jedoch nachgewiesen, dass Veränderungen der Wirtszelllinien, nicht aber resistente Varianten der HCV-Replikons zu dieser Resistenz führten. Auf entsprechende Weise wurde versucht, durch Langzeitbehandlung eine Ribavirinresistenz der Replikons zu induzieren. Ein Überleben der Zellen unter einer hohen Ribavirinkonzentrationen wurde nur beobachtet, wenn die Zellen mit einer Variante des HCV-Replikons transfiziert waren, die eine bestimmte Aminosäuremutation in der NS5A-Region enthielt. Diese Mutation veränderte jedoch nicht die Sensitivität des Replikons selbst gegenüber Ribavirin. Dennoch zeigte dieses Ergebnis, dass das NS5A-Protein die HuH7-Zellen bei der Ausbildung einer zellulären Resistenz gegen Ribavirin unterstützen kann. Der dritte Teil der vorliegenden Arbeit beschäftigte sich mit einer potentiellen antiapoptotischen Funktion des NS5A-Proteins. Zelllinien, in denen verschiedene chimäre HCV-RNAs replizierten, wiesen nach der Behandlung mit TNF-α, einem apoptoseauslösenden Cytokin, geringe Unterschiede in der Überlebensrate auf. Es blieb aber offen, ob dieser Effekt tatsächlich auf das NS5A-Protein oder auf Eigenschaften der Zelllinien zurückzuführen war. Im letzten Abschnitt wurde der Einfluss des NS5A-Proteins auf die Replikation des HCV untersucht. Auch hierzu wurde die Reihe der chimären Con1/AD78-Replikons verwendet. Allerdings enthielten sie statt des Selektionsgens ein Luciferasegen, so dass die Stärke der Replikation dieser Konstrukte in HuH7-Zellen unmittelbar nach der Transfektion bestimmt werden konnte. Die subgenomischen HCV-RNAs wiesen unterschiedliche Replikationsfähigkeiten auf. Durch Vergleich der Aminosäuresequenzen der verschiedenen NS5A-Fragmente wurden Mutationen identifiziert, die nach Einbringen in bestimmte Replikon-Konstrukte die Fähigkeit zu replizieren blockieren oder wiederherstellen konnten. Außerdem wurde gezeigt, dass das Entfernen neu entdeckter potentieller Hyperphosphorylierungsstellen im NS5A-Protein zu einer erhöhten Replikation führte. Diese Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung des NS5A-Proteins für die Replikation des HCV und können in Zukunft wichtige Informationen zur Entwicklung replikationsinhibierender Medikamente liefern.