Tietjens, Anna G.:

Initiale Schritte der Hepatitis C Virusinfektion : Evaluation mit verschiedenen Modellsystemen

Duisburg, Essen (2008), IX, 151 S.
Dissertation / Fach: Biologie
Fakultät für Biologie
Hilgard, Philip (Doktorvater, Betreuerin)
Schade, F. U.; Dittmer, Ulf (GutachterIn)
Dissertation
Abstract:
Die Untersuchung der initialen Schritte der Hepatitis C Virusinfektion waren lange aufgrund fehlender Modellsysteme nicht möglich. Daher wurden im ersten Teil der Arbeit Modellsysteme zur Identifizierung neuer Rezeptormoleküle für das Hepatitis C Virus (HCV) entwickelt. Das erste, ein chimäres Konstrukt bestehend aus den Strukturgenen von HCV und den Nichtstrukturgenen des Dengue Virus (DEN), konnte erfolgreich kloniert werden. Jedoch führte dieses Konstrukt nicht zur Bildung chimärer Viruspartikel. Das zweite Modellsystem ermöglichte, nach erfolgreicher Klonierung, die Expression von rekombinantem HCV E1E2 Glykoprotein in 293HEK Zellen. Obwohl hierbei tatsächlich natives HCV E1E2 Glykoprotein als Heterodimer exprimiert wurde, war die Ausbeute und Reinheit nach der Aufreinigung über den fusionierten His-Tag nicht ausreichend, um es für die vorgesehenen Experimente zu verwenden.
Aus diesem Grund wurden im zweiten Teil der Arbeit für die weitere Evaluation der initialen Schritte der HCV Infektion das kürzlich etablierte HCV Pseudopartikelsystem (HCVpp) verwendet. Damit wurden die Auswirkungen des antiviralen Zytokins Interferon- (IFN-) und der anti-inflammatorischen Zytokine Transforming Growth Factor- (TGF-) und Interleukin-10 (IL-10) auf die Bindung und Aufnahme des Virus in Leberzellen untersucht. Die Stimulation der Hepatomzelllinie Huh-7 mit IFN- resultierte in einer signifikant reduzierten Aufnahme der HCVpp, wohingegen die Inkubation sowohl mit TGF- als auch mit IL-10 die Aufnahme der HCVpp verstärkten. Um die zugrunde liegenden möglichen Mechanismen zu untersuchen, wurden die bereits identifizierten potentiellen Rezeptormoleküle für HCV bezüglich ihrer Expression unter Einfluss von IFN- bzw. TGF- charakterisiert. Hierbei handelte es sich um das Tetraspanninmolekül CD81, den Scavenger Receptor Class B Type I (SR-BI) und das tight junction Molekül Claudin-1. Die Stimulation der Huh-7 Zellen mit IFN- führte zu einer Reduktion der Claudin-1 Expression sowohl auf der Zelloberfläche als auch auf Genexpressionsebene. Die Expression von CD81 und SR-BI blieb jedoch konstant. Somit konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass IFN- seine anti-virale Aktivität nicht nur durch Inhibition der HCV Replikation ausübt, sondern auch eine Neu- bzw. Reinfektion von Zellen reduziert, indem es die Expression eines wichtigen Rezeptormoleküls modifiziert.
Eine Stimulation mit TGF- steigerte die Expression von SR-BI. Die beiden anderen Rezeptormoleküle zeigten keine Reaktion auf TGF-. Somit trägt dieses Zytokin nicht nur durch Veränderung der Immunantwort, sondern auch durch Modulation von Zelloberflächenmolekülen möglicherweise zur Etablierung einer persistierenden HCV Infektion bei.
Genexpressionsanalysen bei Patienten mit einer HCV Infektion haben zur Identifizierung des Zelladhäsionsmoleküls CEACAM1, als ein für das Ansprechen auf Interferon möglicherweise essentielles Protein, geführt. Daher beschäftigte sich der dritte Teil der Arbeit mit CEACAM1 und seiner Rolle bei der HCV Infektion. Hier lag der Fokus einerseits auf der Charakterisierung von CEACAM1 auf Leberzellen (Huh-7, HepG2 und primäre Hepatozyten), sowohl in An- als auch in Abwesenheit von IFN-, und andererseits auf seiner Rolle als potentieller Rezeptor für HCV. Die CEACAM1 Genexpression stieg nach Stimulation mit IFN- an, was auch zu einer erhöhten CEACAM1 Expression auf der Zelloberfläche führt. Eine durch Gen Knock-down verringerte CEACAM1 Expression führte zu einer verstärkten Aufnahme sowohl von HCVpp als auch VSV-Gpp. Da zumindest für HCVpp keine direkte Interaktion mit CEACAM1 gezeigt werden konnte, deuten die Ergebnisse auf eine Abwehrfunktion bei der Virusaufnahme hin. Eine direkte Interaktion konnte nur zwischen CEACAM1 und den VSV-Gpp gezeigt werden. Zudem wurde die Infektion mit VSV-Gpp auf CEACAM exprimierenden HeLa Zellen verstärkt, abhängig von der CEACAM Art. CEACAMs könnten also als potentielle Rezeptormoleküle für das Vesikular Stomatitis Virus (VSV) dienen. Damit wäre das VSV das erste human pathogene Virus, für das CEACAM als Rezeptormolekül identifiziert wurde.

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