Meltzer, Michael:

Struktur- und Funktionsanalyse der hochkonservierten Stressprotease DegP von E. coli

Duisburg, Essen (2008), 167 Bl.
Dissertation / Fach: Biologie
Fakultät für Biologie » Mikrobiologie
Ehrmann, Michael (Doktorvater, Betreuerin)
Siebers, Bettina; Esche, Helmut (GutachterIn)
Dissertation
Abstract:
Die Stressantwort von Escherichia coli wird durch ein komplexes System, bestehend aus einer Signaltransduktionskaskade, Transkriptionsfaktoren, Proteasen, Faltungskata-lysatoren und Chaperonen gesteuert. Eine besonders wichtige Rolle spielt hierbei das hochkonservierte, periplasmatische Hitzeschockprotein DegP mit seiner Doppelfunktion als Chaperon und Protease.
Ziel dieser Arbeit war es, DegP biochemisch und strukturell in seiner Funktionsweise als Protease zu charakterisieren und eine Möglichkeit der medizinischen Anwendung durch eine Inhibierung von DegP zu klären. Als Grundlage für diese Funktionsanalysen wurden die ersten quantifizierbaren Enzymtests mit den neu entwickelten spezifischen Substraten SPMFKGV-pNA und DPMFKLV-pNA etabliert. Hierdurch konnte eine grundsätzliche biochemische Charakterisierung der Proteaseeigenschaft durchgeführt werden, die verdeutlichte, dass DegP eine hohe Toleranz gegenüber vielen Stressbedingungen, wie z.B. pH-Wert und Ionenstärke aufweist, wodurch es in vivo seine Funktion in der Stressantwort aufrecht erhalten kann. In weiteren Versuchen konnten erste Inhibitoren in Form von Chloromethylketon- und Boronsäurederivaten der Substrate für DegP entwickelt werden, die zusätzlich eine Röntgenkristallstrukturanalyse von DegP im aktiven Zustand mit gebundenem Substrat vorantreiben sollten.
Bei den Analysen der enzymatischen Funktion konnte die für DegP neue Form der allosterischen Aktivierung bestimmt werden. Diese Aktivierung wird durch fehlgefaltete Proteine und kleine Peptide, die in vivo Stresssignale darstellen, ausgelöst. Bisher konnte nur gezeigt werden, dass die Proteasefunktion von DegP durch ein temperaturabhängiges System gesteuert wird und bei hohen Temperaturen aktiv ist, wohingegen bei niedrigen Temperaturen ddie Chaperonfunktion überwiegt (Spiess et al., 1999). Nachteil dieser Regulation ist, dass nicht alle Stressbedingungen mit einer solchen Veränderung in vivo einhergehen. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die Proteasefunktion auch bei niedrigen Temperaturen allosterisch aktiviert werden kann und DegP so universell auf Stressbedingungen reagieren kann. Dies unterstreicht die wichtige Funktion in der Stressantwort bei E. coli.
Durch Oligomerisierungsanalysen mittels Gelfiltration, Cross-Link Methode und analytischer Ultrazentrifugation konnte zusätzlich eine Veränderung des oligomeren Zustandes von DegP infolge der allosterischen Aktivierung bestimmt werden. Das hexamere DegP kann durch Bindung der Aktivatoren, vermutlich an die PDZ1 Domäne, zu einem Dodecamer bzw. 24mer hocholigomerisieren. Durch Analysen der Enzymaktivität der einzelnen DegP Zustände konnte gezeigt werden, dass das Hexamer nur eine Art Ruhezustand und das Dodecamer und das 24mer die enzymatisch aktiven Zustände darstellen.
Durch Mutantenanalysen konnte die essentielle Rolle der sogenannten Loop Triade, insbesondere die des LA Loops, deutlich gemacht werden. Ziel dieser Analysen war es, die Interaktion der Loop Triade bildenden Loops LA, L1 und L2 zu unterbinden und somit den funktionellen und strukturellen Einfluss der Loop Triade zu klären. Durch den Austausch einzelner, für die Interaktion des LA Loops mit dem L2 Loop essentieller Aminosäuren, konnten DegP Derivate hergestellt werden, die zwar die prinzipiellen Funktionen von DegP zeigten, aber bereits ohne die Zugabe von Aktivatoren einen hocholigomeren Zustand aufwiesen. Dies veranschaulicht zum einen die stabilisierende Funktion der Loop Triade für das Hexamer und zum anderen die Funktion als regulatorische Einheit im Wechsel zwischen dem proteolytisch relativ inaktiven Hexamer und den aktiven Formen des Dodecamers und 24mers.
Weiterhin konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass degP nicht nur durch den Transkriptionsregulationsmechanismus von RpoE kontrolliert wird, sondern darüber hinaus als Protease selbst einen entscheidenden Faktor bei der Feinregulation der Stressantwort darstellt. Neben der Funktion als Chaperon, die es DegP ermöglicht, an der Maturation des Außenmembranproteins OmpC beteiligt zu sein, weist DegP eine unter Stress-bedingungen auftretende zusätzliche Funktion als Protease des fehlgefalteten OmpC auf. Diese Proteolyse ist dabei der Auslöser für die Stressantwort der Zelle über den RpoE Regulationsmechanismus. Des weiteren konnte die Hypothese aufgestellt werden, dass DegP direkt an der Proteolyse des Antisigmafaktors RseA beteiligt ist und so den limitierenden Schritt in der Hitzeschockantwort der Zelle aufhebt.
Durch die in dieser Arbeit nachgewiesene wichtige Rolle in der Stressantwort rückt DegP in den Fokus für die Entwicklung neuer Antibiotika. Auf Grundlage des entwickelten Enzymtests sollten z.B. High Throughput Screens ermöglichen, spezifische Inhibitoren zu entwickeln, die in der medizinischen Anwendung genutzt werden könnten.