Sinnen, Christian:

Untersuchungen zur Domäneninfektion von hPin1 mit NMR

Duisburg, Essen (2009), IX, 114 Bl.
Dissertation / Fach: Biologie
Fakultät für Biologie
Bayer, Peter (Doktorvater, Betreuerin)
Hoffmann, Daniel (GutachterIn)
Dissertation
Abstract:
In der Kristallstruktur (1PIN) der Peptidyl-Prolyl-cis/trans-Isomerase Pin1 (Ranganathan et al., 1997) wechselwirken die beiden Domänen des Proteins (WW- und PPIase-Domäne) über ein gemeinsames Interface miteinander. Zwischen den Domänen ist ein niedermolekulares Polyethylenglykol-Molekül (Peg400) gebunden. NMR-Spektroskopische Untersuchungen hatten nahe gelegt, das diese Wechselwirkung der beiden Domänen in Lösung dynamisch betrachtet werden muss und zwei Konformationen vorliegen sollten, die als offene (Domänen interagieren nicht) und geschlossene (Domäneninteraktion ist vorhanden) bezeichnet werden (Bayer et al., 2003; Jacobs et al., 2003).
In dieser Arbeit wurde die Interaktion der beiden Domänen mit Hilfe der NMR-Spektroskopie untersucht. In 15N-HSQC-Spektren von Pin1 lassen sich Resonanzen erkennen, die mit abnehmender Temperatur aufspalten und mit steigender Temperatur aufeinander zu laufen. Diese aufspaltenden Signale konnten Aminosäuren der WW-Domäne zugeordnet werden, die im Bindungsinterface beider Domänen liegen.
Vorarbeiten aus der Arbeitsgruppe legten nahe, dass die Aufspaltungen ihre Ursache in einer Domäneninteraktion haben könnten. Aus der Tatsache, dass sich die Signalintensitäten (Populationen beider Zustände) mit zunehmender Temperatur ändern und dieser Vorgang reversibel ist, lässt sich ein dynamisches Gleichgewicht zwischen den im HSQC beobachteten Zuständen ableiten, so wie es auch von Bayer und Jacobs für die offene und geschlossene Konformation von Pin1 postuliert wurde. Danach würden die beiden aus dem aufspaltenden Signal resultierenden Peaks repräsentativ für die beiden Konformationen stehen. Ist dem so, sollte das Gleichgewicht bei Zugabe eines Liganden, der die Domäneninteraktion verstärkt, auf die Seite der geschlossenen Konformation verschoben werden können.
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Peg400 die Domäneninteraktion genau auf diese Weise beeinflussen kann. Eine Zugabe von Peg400 zu einer Lösung von Pin1 bewirkt eine Verstärkung der Aufspaltungen in den HSQC-Spektren und eine Veränderung der Signalstärken der beiden einzelnen Peaks (Veränderung der Population). Peg hat demnach einen Einfluss auf das Gleichgewicht, indem es die Population der geschlossenen Konformation erhöht und die der offenen vermindert.
Die freie WW-Domäne (Pin1WW) und eine Pin1 Variante mit einem verkürzten Linker (shortPin1) induzieren keine Aufspaltungen. In beiden Konstrukten ist die Domäneninteraktion nicht möglich oder eingeschränkt. Aus den Versuchen wird deutlich, dass sowohl die Anwesenheit beider Domänen als auch die des vollständigen Linkers für das Auftreten von Aufspaltungen im N-HSQC notwendig sind.
Aus 15N-HSQC Spektren konnten über eine Titrationsreihe unter Zugabe des Modellsubstrats Suc-Ala-pSer-Pro-Phe-pNA Dissoziationskonstanten für die geschlossene und offene Konformation bestimmt werden. Die gemittelten KD-Werte zeigen, dass die geschlossene Konformation das Peptid zweimal so stark bindet, wie die offene. Eine mögliche funktionelle Relevanz beider Konformationen könnte daher in der unterschiedlichen Bindung von Substraten und einer nachfolgenden unterschiedlichen katalytischen Aktivität liegen. Wozu dies in vivo nützlich sein könnte, bleibt spekulativ und Bedarf neuer zellulärer Studien.
Die vorliegende Arbeit bietet einen Ansatz für eine schnelle Screening-Methode um Aktivatoren oder Inhibitoren der Domäneninteraktion von Zwei- und Multidomänenproteinen mit Hilfe von 15N-HSQC-Spektren zu untersuchen.

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