Hasenäcker, Frank:

Speziation von Metall-Protein-Assoziationen in Humanblut mittels multidimensionaler Trennverfahren

Duisburg, Essen (2008), 165 S.
Dissertation / Fach: Chemie
Fakultät für Chemie » Analytische Chemie
Hirner, Alfred V. (Doktorvater, Betreuerin)
Goedeke, W (GutachterIn)
Dissertation
Abstract:
Metall-Protein Assoziationen spielen in verschiedensten physiologischen Prozessen eine entscheidende Rolle. Aufgrund der anspruchsvollen Analytik stehen hierbei insbesondere im Bereich der nicht kovalent gebundenen Metall-Protein-Komplexe nur sehr wenige Analyseverfahren, welche Untersuchungen von unbekannten Metall-Protein Assoziationen ermöglichen, zur Verfügung. Daher wurde ein mehrdimensionales automatisiertes HPLC-System konzipiert, welches den flexiblen Einsatz verschiedener nativer Separationsschritte sowohl im ein- als auch im zweidimensionalen Betrieb ermöglicht. Die entwickelte HPLC-Methode zeichnet sich durch die Möglichkeit aus, eine Vielzahl von Informationen in nur einem Chromatographielauf zu gewinnen. Im Gegensatz zu den aus der Literatur bekannten chromatographischen Trenntechniken wurde hier erstmals ein mehrdimensionales HPLC-System etabliert, welches zum einen eine native Proteinseparation von unbekannten Metall-Protein Assoziationen aus humanen Blutplasma erlaubt und gleichzeitig die Möglichkeit der Quantifizierung von Metallen und den Heteroelementen Phosphor und Schwefel bietet. Die induktiv gekoppelte Plasma Massenspektrometrie ermöglicht hierbei eine äußerst nachweisstarke Multielementdetektion. In komplexen biologischen Matrices wird jedoch der Nachweis vieler Elemente durch isobare molekulare Interferenzen limitiert. Diese Limitierungen können durch den Einsatz der Kollisions/Reaktionszellentechnologie, welche neben der Minimierung von Artefakten ebenfalls die Analyse von stark interferierten Elementmassen wie 40Ca, 31P und 32/34S erlaubt, weitgehend aufgehoben werden.
Des weiteren wurde die Kalibration der ICP-MS durch die Etablierung einer neuen schnellen Gradientenkalibration (FGC), sowohl im Bezug auf die Kalibrationszeit als auch die statistische Absicherung der Daten optimiert. Dieses Kalibrationssystem wurde anhand von zertifizierten Referenzmaterialien validiert und in das multidimensionale HPLC-System integriert, was ein hohes Maß an Automatisierung ermöglicht. Hierdurch werden stöchiometrische Informationen durch die Bestimmung von Metall/Schwefel- und Metall/Phosphorverhältnissen zugänglich.
Durch die Verwendung von präparierten Trennsäulen in der zweiten Trenndimension und im Trap-System konnten die Säulendimensionen an die Bedürfnisse der Anlage angepasst werden. Die Experimente zur Charakterisierung des Trap-Systems zeigten hierbei eine reproduzierbare Qualität bei der Präparation der Säulen. Des weiteren wurde eine Abhängigkeit der Trapeffektivität vom isoelektrischen Punkt der Analyten beobachtet.
Die Kombination der qualitativen und quantitativen ICP-MS Daten und die Masseninformation, welche mit Hilfe der SEC gewonnenen wurden, ermöglichen den Vergleich mit Literaturdaten, was bei der Analyse von Blutplasma zu zahlreichen Übereinstimmungen geführt hat und somit Rückschlüsse auf die Metall- und Proteinverteilung im Blutplasma erlaubt. Des weiteren konnten einzelne Metall-Protein Assoziationen mit Hilfe der MALDI-Analytik über das M+ Signal und den Vergleich mit Standards identifiziert werden. Die Anwendung von Verdautechniken kann hierbei weitere Möglichkeiten zur Identifikation eröffnen.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde erstmalig eine neue Methode zur online Kopplung von HPLC-Systemen mit der Gelelektrophorese eingesetzt, um die Nativität des nunmehr dreidimensionalen Trennsystems zu untersuchen. Durch den Einsatz des hierfür entwickelten HPLC-GE Interface, welches den Probentransfer auf das Gel und die Modifikation des HPLC Eluenten ermöglicht, der nachfolgenden Gelelektrophorese und des abschließenden Tests, konnte der Erhalt der enzymatischen Aktivität exemplarisch für ein Metallprotein (Alkalische Phosphatase, Kalb) nach der Separation bestätigt werden.
Mit Hilfe der online-Kopplung von HPLC und Gelelektrophorese wird die mehrdimensionale HPLC, nach vorangegangener Entwicklungsarbeit (vgl. Kapitel 5.5),um eine weitere leistungsstarke Trenndimension erweitert werden können.
Die hohe Flexibilität des multidimensionalen HPLC-Systems, die erreichte Trennleistung mit der Option der massenspektrometrischen Speziation und der Erhalt der enzymatischen Aktivität während der gesamten Separation ermöglichen in Kombination mit der qualitativen und quantitativen Elementinformation die Analyse von unbekannten Metall-Protein Assoziationen in komplexen biologischen Matrices. Des weiteren kann das hier vorgestellte 2D-HPLC-System durch einfachen Säulentausch an speziellere Problemstellungen wie zum Beispiel die Metallthioninanalytik angepasst werden.

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