Braak, Michael ter:

Regulation zellulärer Funktionen durch Enzyme des Sphingosin-1-Phosphat-Metabolismus

Duisburg, Essen (2008), 135 Bl.
Dissertation / Fach: Biologie
Medizinische Fakultät » Universitätsklinikum Essen » Institut für Pharmakologie
Jakobs, Karl Heinrich (Doktorvater, Betreuerin)
Esche, Helmut (GutachterIn)
Dissertation
Abstract:
Das im menschlichen Organismus ubiquitär vorkommende, bioaktive Lysophospholipid Sphingosin-1-Phosphat (S1P) wurde lange Zeit lediglich als Zwischenprodukt des Sphingolipid-Metabolismus angesehen. Erst in den letzten zwei Jahrzehnten wurde die große Bedeutung des S1P in der Signaltransduktion und damit als Regulator einer Vielzahl zellulärer Prozesse erkannt. Dabei spielt die subzelluläre Lokalisation des Lipid-Mediators S1P für die jeweilige zelluläre Reaktion eine wichtige Rolle. Einerseits wirkt das durch Sphingosinkinasen (SphK) gebildete S1P intrazellulär als second messenger, andererseits werden viele Wirkungen des S1P durch dessen Bindung an fünf spezifische G-Protein-gekoppelte Rezeptoren vermittelt. In der vorliegenden Arbeit wurde die Steuerung der lokalisierten S1P-Bildung und ihre Konsequenzen anhand der Gq-vermittelten SphK-Translokation, an S1P-Lyase-defizienten Zellen sowie mit Hilfe des Sphingosin-Analogons cis-4-MSph untersucht.
Im ersten Teil wurde der molekulare Mechanismus der durch den M3-Rezeptor stimulierten SphK1-Translokation näher charakterisiert. Dabei konnte mit Hilfe der phosphorylierungsdefizienten Mutante SphK1S225A gezeigt werden, daß die Phosphorylierung des Ser225 der humanen SphK1 nicht essentiell für die Translokation durch den M3-Rezeptor ist und diese somit einen anderen Mechanismus als die durch TNF-α oder Phorbolester induzierte SphK1-Translokation aufweist. Durch den Vergleich der SphK1-Translokation mit der Translokation anderer an der Gq-vermittelten Signaltransduktion beteiligten Enzyme, wurden zuvor durchgeführte Untersuchungen ergänzt, die eine Rolle von klassischen Gq-vermittelten Signalwegen bei der M3-Rezeptor-stimulierten SphK1-Translokation ausgeschlossen hatten. Schließlich wurde durch Coimmunopräzipitationsstudien zum ersten Mal eine wahrscheinlich direkte Interaktion von Gαq und SphK1 nachgewiesen. Durch Untersuchungen an SphK1-Fragmenten konnte gezeigt werden, dass der Bereich zwischen den Aminosäuren Val350 und Met377 sowie die N-terminalen Aminosäuren vor Position 110 der humanen SphK1 essentiell für die M3-stimulierte SphK1-Translokation sind. Bei den Untersuchungen zur funktionellen Bedeutung der SphK1-Translokation wurde festgestellt, dass die Stimulation des M3-Rezeptors zu einer Internalisierung der überexprimierten S1P-Rezeptoren S1P1, S1P2 und S1P3 führte. Mit Hilfe der SphK1-Mutante SphK1G82D, der S1P1-Rezeptormutante S1P1R292A und des S1P1/3-Antagonisten VPC23019 konnte gezeigt werden, dass hierfür die katalytische Aktivität der SphK1 sowie die Bindung von S1P an den S1P1-Rezeptor benötigt wird. Auch die Expression von konstitutiv aktivem Gαq, welche eine SphK1-Translokation bewirkt, führte zur Internalisierung des S1P1-Rezeptors. So konnte gezeigt werden, dass Gq-gekoppelte Rezeptoren über die autokrine/parakrine Aktivierung von S1P-Rezeptoren vermutlich Gi- und G12/13-Signalwege aktivieren können.
Im nächsten Teil der Arbeit wurde die Calcium-Homöostase in S1P-Lyase defizienten embryonalen Mausfibroblasten (SGPL1-/--MEFs) untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass sowohl die basale intrazelluläre Calciumkonzentration ([Ca2+]i) als auch die durch Agonisten induzierten [Ca2+]i-Anstiege in diesen Zellen, im Vergleich zu den Wildtyp-Fibroblasten (SGPL1+/+-MEFs), signifikant erhöht waren. Die durch Thapsigargin induzierten [Ca2+]i-Anstiege waren signifikant höher und verliefen schneller. Die Ca2+-Speicherung war also gesteigert, was auch die Verstärkung der durch Agonisten induzierten [Ca2+]i-Anstiege erklärt. Auch in Abwesenheit von extrazellulärem Ca2+ waren die basale [Ca2+]i und die durch Thapsigargin induzierten [Ca2+]i-Anstiege erhöht. Diese Wirkungen kamen also nicht durch einen verstärkten Ca2+-Einstrom zustande. Durch Hemmung der SphK wurde die erhöhte basale [Ca2+]i deutlich reduziert, was nahelegt, dass die Ursache der veränderten Ca2+-Homöostase der erhöhte S1P-Spiegel in den SGPL1-/--MEFs sein könnte. Außerdem konnte eine abnormale Speicherung des Ca2+-sensitiven Fluoreszenzfarbstoffes Fluo-4 in Lysosomen und ER der SGPL1-/--MEFs beobachtet werden.
Im dritten Teil der Arbeit wurden die zellulären Wirkungen des Sphingosin-Analogons cis-4-Methylsphingosin (cis-4-MSph) untersucht. Es war bekannt, dass cis-4-MSph intrazellulär zum metabolisch stabilen cis-4-MS1P phosphoryliert wird, welches sich im Gegensatz zum kurzlebigen S1P intrazellulär anreichert. Die akute Stimulation mit cis-4-MSph induzierte transiente [Ca2+]i-Anstiege, welche langsamer als die durch S1P, aber schneller als die durch Sphingosin verliefen. Eine Vorinkubation mit cis-4-MSph führte zu einer spezifischen Hemmung der [Ca2+]i-Anstiege durch S1P. Diese Hemmung war nicht nur von der Konzentration, sondern auch von der Inkubationszeit abhängig. Desweiteren war die Hemmwirkung in SPHK1-/--MEFs deutlich abgeschwächt und folglich von der cis-4-MS1P-Bildung abhängig. Schließlich wurde festgestellt, dass die Langzeitinkubation mit cis-4-MSph eine Internalisierung der an [Ca2+]i-Anstiege koppelnden S1P2- und S1P3-Rezeptoren induzierte. Die Hemmung der S1P-induzierten [Ca2+]i-Anstiege durch cis-4-MSph beruhte also auf einer durch cis-4-MS1P induzierten Internalisierung von S1P-Rezeptoren. Damit hat cis-4-MSph eine ähnliche Wirkung wie das Sphingosin-Analogon FTY720, wobei sich jedoch die Rezeptor-Profile der beiden Substanzen unterscheiden.