Benzrath, Stefanie:

Funktionelle Untersuchungen der G-Proteinuntereinheit G Beta 3 und einer Spleissvariante G Beta 3 s

Duisburg, Essen (2007), 77 Bl.
Dissertation / Fach: Medizin
Medizinische Fakultät » Universitätsklinikum Essen » Institut für Pharmakologie
Siffert, Winfried (Doktorvater, Betreuerin)
Jendrossek, Verena (GutachterIn)
Dissertationen
Abstract:
Heterotrimere G-Proteine spielen in der Signaltransduktion eine wichtige Rolle. G-Proteine gehören zu der Superfamilie der „Propellerproteine“, die 7 „Propellerblätter“ besitzen, welche aus 7 WD-Domänen gebildet werden. G3s ist eine Spleissvariante, die durch alternatives Spleissen 41 Aminosäuren, das heißt eine WD-Domäne und damit ein „Propellerblatt“ weniger enthält. Vorhergehende Untersuchungen zeigten eine Assoziation dieser alternativen Spleissvariante G3s mit dem T-Allel des GNB3 C825T Polymorphismus auf. In verschiedenen Assoziationsstudien konnten Zusammenhänge zwischen dem Vorhandensein des T-Allels und Erkrankungen, z.B. des Herzkreislaufsystems, festgestellt werden. Einen Einfluss auf die Effektivität verschiedener Medikamente wurde beobachtet.
Ziel der vorliegenden Arbeit war eine funkionelle Untersuchung der Spleissvariante G3s auf zellulärer Ebene im Vergleich zur Wildtypvariante G3L. Hierzu wurden rekombinante Baculoviren, die G3L, G3s und M1-Acetylcholin-Rezeptor kodieren, hergestellt. Nach Klonierung der entsprechenden cDNA-Sequenzen in einen Shuttle-Vektor konnte eine Rekombination in die Baculovirus-DNA stattfinden. Mittels Sequenzierung wurden die genetische Information überprüft. Zunächst erfolgte die Virusamplifikation. Im folgenden Schritt wurden Sf9-Zellen infiziert und die Membranen präpariert, um mittels Westernblotuntersuchung die Proteine erwarteter Größe nachzuweisen. Die funktionellen Untersuchungen erfolgten mittels eines Fluoreszenzmikroskopes. Nach entsprechender Infektion der Sf9-Zellen mit den Baculoviren für einen der beiden G3-Untereinheiten und den M1-Acetylcholinrezeptor wurden die intrazellulären Ca++-Signale der Sf9-Zellen gemessen. Dadurch konnte gezeigt werden, dass es bei Expression der G3s-Untereinheit zu einer stärkeren Kalziumausschüttung kommt als bei der Expression des Wildtyps. Die biologische Aktivität der G3s-Untereinheit scheint höher zu sein als die der G3L-Untereinheit, was die bisherigen funktionellen Daten sowie klinischen Beobachtungen hinsichtlich der Funktion und Auswirkung des GNB3 825T-Allels unterstützt.

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