Schulte, Ina:

Charakterisierung der zellulären Immunantwort nach Infektion mit dem Woodchuck-Hepatitis-Virus (WHV) in nordamerikanischen Waldmurmelltieren

Duisburg, Essen (2007), 121 Bl.
Dissertation / Fach: Biologie
ehem. Fakultät für Biologie und Geografie
Roggendorf, Michael (Doktorvater, Betreuerin)
Grümmer, Ruth (GutachterIn)
Dissertation
Abstract:
Für Studien zur Pathogenese einer hepadnaviralen Infektion hat sich das mit dem Woodchuck Hepatitis Virus (WHV) infizierte nordamerikanische Waldmurmeltier (engl. woodchuck) als Modellsystem etabliert. Während der akute, selbst-limitierende sowie der chronische Infektionsverlauf hinsichtlich der T-Helferzell-antworten gegen virale Proteine in diesem Modell bereits gut charakterisiert ist, war der Nachweis von zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) bislang nicht möglich. In der vorliegenden Arbeit wurde die WHV-spezifische CTL-Anwort im Murmeltiermodell erstmals charakterisiert.
Im ersten Teil wurde die zelluläre Immunantwort gegen das virale Oberflächenprotein WHsAg nach DNA-Vakzinierung im gut charakterisierbaren Mausmodell dargestellt, um die generelle Anwendbarkeit der verwendeten Technik zu zeigen („proof of principle“). Zur Kartierung von T-Zell-Epitopen wurde ein Stimulationsprotokoll mit überlappenden Peptiden und anschließender durchflusszytometrischer Analyse der Zytokinproduktion etabliert. Dabei wurden zwei Peptide identifiziert, welche potentielle Epitope von CD4+ T-Zellen darstellten. Das Oberflächenprotein von WHV war folglich dazu in der Lage, zelluläre Immunantworten zu induzieren. Für CD8+ T-Lymphozyten wurde bisher kein WHsAg-spezifisches Epitop kartiert. Dennoch wurde gezeigt, dass das etablierte Stimulationsprotokoll für die Identifizierung von T-Zell-spezifischen Epitopen und damit für die Charakterisierung der zellulären Immunantwort geeignet ist.
Im Anschluss daran wurde eine Nachweismethode für WHV-spezifische CTL etabliert, welche auf der Detektion des degranulationsassoziierten Markers CD107a nach Peptidstimulation basierte. Aufgrund der starken Ähnlichkeit des Woodchuck-CD107a zu dem anderer Spezies wurde ein kreuzreaktiver, monoklonaler anti-CD107a-Antikörper identifiziert, mit dem die durchflusszytometrischen Analysen durchgeführt werden konnten. Nach der Etablierung der Methode an Splenozyten immuner Tiere und der Identifizierung eines kapsidspezifischen CTL-Epitopes (c96-110) wurde die Kinetik der virusspezifischen CTL-Antwort im Verlauf der akuten WHV-Infektion untersucht. Dabei wurde gezeigt, dass eine starke CTL-Antwort gegen c96-110 induziert wurde, welche mit der Eliminierung des Virus aus dem peripheren Blut korrelierte. Die Immunantwort gegen ein WHsAg-spezifisches Epitop (s220-234) war weniger stark ausgeprägt. Chronisch WHV-infizierte Murmeltieren zeigten keine nachweisbare CTL-Antwort gegen das WHcAg-Epitop c96-110. Die zytotoxische
T-Zellantwort gegen das Kapsidantigen spielte folglich eine entscheidende Rolle für die Eliminierung des Virus.
Da das identifizierte Peptid c96-110 von der Mehrheit der akut oder post-akut WHV-infizierten Tiere erkannt wurde, war die Restriktion des Epitopes für ein bestimmtes MHC (major histocompatitibility complex) Klasse I-Allel zu vermuten. Eine Typisierung der Mamo I genannten MHC-Gene erbrachte jedoch keinen Hinweis auf ein immundominantes Allel.
Die Bedeutung der identifizierten CTL-Epitope für die Viruseliminierung wird in zukünfigen Studien durch gezielte Mutagenese der entsprechenden viralen Sequenzen untersucht werden.

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