Rattmann, Ina:

Retroviraler Gentransfer des Chemotherapie-Resistenzgens Cytidindeaminase in hämatoptische Stamm- und Vorläuferzellen

Duisburg, Essen (2006), 114 Bl.
Dissertation / Fach: Biologie
Fakultät für Biologie
Opalka, Bertram (Doktorvater, Betreuerin)
Klein-Hitpaß, Ludger (GutachterIn)
Dissertation
Abstract:
Die Cytidindeaminase (CDD) deaminiert Cytidin und dessen Analoga AraC und Gemcitabin, die als Chemotherapeutika gegen eine Vielzahl unterschiedlicher maligner Erkrankungen eingesetzt werden. Eine wesentliche und häufig dosislimitierende Nebenwirkung beider Substanzen ist die Myelosuppression, die oft eine adäquate Dosierung und somit die Ausschöpfung des therapeutischen Potenzials dieser Substanzen verhindert. Die Überexpression der CDD schützt Zellen vor den toxischen Wirkungen der Cytidinanaloga. Ziel dieser Arbeit war es daher, den durch die Überexpression der CDD mittels retroviralen Gentransfers vermittelten Schutzeffekt in hämatopoetischen Zellen zu untersuchen.
Für eine effiziente Transduktion hämatopoetischer Zellen werden hochtitrige Viruspräparationen benötigt. Daher wurde im ersten Schritt dieser Arbeit eine neue stabile ecotrope Verpackungszelllinie hergestellt, die es ermöglichte, Viruspräparationen mit infektiösen Titern von bis zu 6 x 106 IE/ml zu produzieren. Mit diesen Viruspräparationen ließ sich eine Gentransfereffizienz von bis zu 70 % in primären hämatopoetischen Zellen, sowie ca. 40 % für langzeitrepopulierende Stammzellen, erreichen. Darüber hinaus wurde anhand von In-vitro-Experimenten gezeigt, dass humane hämatopoetische Vorläuferzellen durch die retroviral vermittelte Überexpression der CDD vor der Toxizität nicht nur von AraC sondern auch von Gemcitabin geschützt werden können und dass sich CDD-transduzierte humane hämatopoetische Vorläuferzellen zumindest in vitro mittels AraC selektionieren lassen. Im murinen Knochenmarktransplantationsmodell wurde erstmalig in vivo nachgewiesen, dass nach der Transplantation von CDD-transduzierten Knochenmarkzellen die Hämatopoese vor den zytotoxischen Wirkungen von AraC und Gemcitabin geschützt wird. Selbst 6 Monate nach Transplantation von CDD-transduzierten mononukleären Knochenmarkzellen wurde hierbei noch eine stark erhöhte Enzymaktivität (um das bis zu 149-fache) in Knochenmark- und Milz-Zellen einhergehend mit einer profunden AraC-Resistenz von klonogenen Vorläuferzellen aus dem Knochenmark (bis zu 1000 nM) nachgewiesen. Aufgrund dieses Schutzeffektes und der vorangegangenen erfolgreichen In-vitro-Selektion in humanen Zellen wurde untersucht, ob sich das CDD-Gen auch als In-vivo-Selektionsmarkergen eignet. Allerdings konnten mit den in dieser Arbeit angewandten Applikationsschemata keine Selektion CDD-transduzierter Zellen mit AraC oder Gemcitabin erreicht werden. Zusätzlich wurde anhand von Langzeitanalysen gezeigt, dass die Überexpression der CDD keinen wesentlichen toxischen Effekt auf das Stammzellkompartiment ausübt. Allerdings wurde auch offensichtlich, dass Überexpression der CDD einen ausgeprägten inhibitorischen Effekt auf die Lymphopoese und einen schwachen inhibitorischen Effekt auf myeloische Zellen ausübt.
Zusammenfassend haben die Ergebnisse dieser Arbeit bestätigt, dass sich die Cytidindeaminase als potentielles Chemotherapie-Resistenzgen im Einsatz gegen klinisch hochrelevante Zytostatika eigenen könnte, womit ein weiterer Schritt in Richtung einer potentiellen klinischen Anwendung des retroviralen CDD-Gentransfers vollzogen wurde.