Khandanpour, Cyrus:

Affinitätschromatographie mit orientiert und nicht-orientiert immobilsisiertem Calmodulin am Beispiel der Aufreinigung der Ubiquityl-Calmodulin-Synthetase Faktor 2

Duisburg-Essen (2005), 99 Bl.
Dissertation / Fach: Medizin
Medizinische Fakultät » Universitätsklinikum Essen » Institut für Physiologische Chemie
Jennissen, Herbert (Doktorvater, Betreuerin)
Dissertation
Abstract:
Im Rahmen dieser Dissertation gelang es eine zielgerichtete Immobilisierung des Calmodulins durch Verwendung des Glutathion-S-Transferase-Calmodulin-Fusionspro-teins (GST-Calmodulin) zu erreichen. Das neue GST-Calmodulin-Gel wurde zur Auf-reinigung von Ubiquityl-Calmodulin-Synthetase Faktor 2 (uCaM Syn-F2) eingesetzt. Da-durch konnte die Ausbeute um Faktor zwei gegenüber der bisher verwendeten Methode mit ungerichtet immobilisiertem Divinylsulfon-Calmodulin gesteigert werden. Von den Ausgangsüberlegungen her hätte dieser Faktor aber etwa sechs betragen müssen, da den sechs verschiedenen Lysinen des Calmodulins im Falle der Divinylsulfon-Kopplung nur ein N-Terminus im Falle der Immobilisierung des GST-Calmodulins gegenüber stand. Die Diskrepanz zwischen dem erwarteten Ergebnis und dem tatsächlich beobachteten Befund wurde so gedeutet, dass im Falle der ungerichteten Immobilisierung möglicherweise nur zwei Lysine des Calmodulins an der Kopplung teilnehmen. Von diesen sich ergebenden Orientierungen würde nur eine die Interaktion mit calmodulinbindenden Proteinen ermöglichen. Diese Vorstellung wiederum erklärt das ähnliche Verhalten im Vergleich zur streng orientierten Immobilisierung des Fusionsproteins am N-Terminus. Auf der Basis bioinformatorischer Untersuchungen wurden verschiedene Modellvorstellungen, wie z.B. Force-Field und Zugänglichkeit, überprüft um so die Bevorzugung bestimmter Lysine zu erklären. Als Anwendungsbeispiel diente hierbei die Ribonuclease, von der bekannt war, dass sie nur über zwei Lysine an die Sepharose gebunden wird. Jedoch konnte keine Modellvorstellung die Bevorzugung einzelner Lysine erklären. Als abschließender Ansatz könnte die unterschiedliche Aktivierungsenergie der einzelnen Lysinseitengruppen eine Erklärung für die eingeschränkte Zahl reaktiver Lysine liefern. Die Aufreinigung der uCaM Syn-F2 an dem neuen Gel ergab, dass uCaM Syn-F2 durch proteolytische Einflüsse während des Lagerns in seinen biochemischen Eigenschaften (z.B. Molekulargewicht und Affinität zum Anionenaustauschergel MonoQ) verändert wurde. Die Proteolyse wurde durch die Anwesenheit von Calcium und der damit bedingten Aktivierung von Calpain verstärkt. Erst durch den Einsatz von Proteaseinhibitoren und kurzen Lagerungszeiten konnten die proteolytischen Einflüsse minimiert werden. Auf Grund hoher Verlusten bei der Anionenaustauschchromatographie wurde versucht, uCaM Syn-F2 durch die, in der Literatur beschriebenen, Blot-Overlay-Verfahren nachzuweisen. Diese Methoden ließen sich im Falle der uCaM Syn-F2 nicht reproduzieren, erst durch eine, in dieser Arbeit neue entwickelten, Overlay-Methode ließ sich eine 31 kDa große Bande als mögliche calmodulinbindende Komponente der uCaM Syn-F2 identifizieren.

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