Lehmkühler, Oliver:

Funktion des Adenovirus Serotyp 12 E1A-Gens bei der malignen Transformation primärer Mauszellen

Essen (2002)
Buch / Monographie / Fach: Allgemeines, Sonstiges
Medizinische Fakultät » Universitätsklinikum Essen » Institut für Molekularbiologie (Tumorforschung)
Fakultät für Biologie
Abstract:
Die E1A-Proteine sind verantwortlich für die unterschiedliche Onkogenität der verschiedenen Ad-Serotypen in nicht-permissiven Wirtssystemen. Sie vermitteln ihre Funktionen über Protein-Protein-Interaktionen mit zellulären Faktoren, die u. a. an der Regulation des Zellzyklus, der Differenzierung oder der Apoptose beteiligt sind. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Identifizierung neuer onkogener Determinanten in der E1A-Region des hoch onkogenen Ad12. Die Untersuchungen wurden an BALB/c-Zelllinien vorgenommen, die entweder durch die Ad12-E1Awt-Region oder eine Ad12-E1A-Mutante, die aufgrund einer Punktmutation die Proteine Ad12-E1A10S/11S und Ad12-E1A9,5S nicht mehr synthetisieren kann, in Kombination mit Ad12-E1B transformiert sind. Durch die Charakterisierung der generierten Zelllinien habe ich zwei Ad12-E1Awt-Zelllinien, drei Ad12-E1Am-Zelllinien, eine Ad12-13Swt-Zelllinie sowie drei Ad12-13Sm-Zelllinien selektiert, die für weitere in vitro und in vivo Studien verwendet wurden. Meine Studien belegen, dass für die Transformation primärer Zellen durch Ad12-Genprodukte die Expression einer Ad12-13S-cDNA oder der Ad12-E1Am-Region zusammen mit Ad12-E1B ausreicht. Für eine effektive Tumorinduktion in immunkompetenten syngenen Mäusen müssen jedoch neben Ad12-E1A13S und Ad12-E1A12S auch die Proteine Ad12-E1A10S/11S und/oder Ad12-E1A9,5S exprimiert werden. Mit Hilfe von FACS-Analysen konnte ich außerdem erstmalig zeigen, dass für eine effektive Suppression der MHC-Klasse-I-Expression auf der Oberfläche Ad12-transformierter Zellen das Protein Ad12-E1A13S alleine nicht ausreicht. Bei zusätzlicher Berücksichtigung der Tumorinduktionsstudien wird zudem deutlich, dass eine Korrelation zwischen der vollständigen Repression der MHC-Klasse-I-H2- k d -Expression und einer Tumorigenität in immunkompetenten syngenen Mäusen besteht. Die Expression der Proteine Ad12-E1A10S/11S und/oder Ad12-E1A9,5S ist somit von großer Bedeutung für die onkogene Transformation durch Ad12-E1-Genprodukte. Einen weiteren Schwerpunkt meiner Arbeit bildete die Untersuchung der Rolle des zellulären Kofaktors p300 bei der Transformation durch Ad12-E1-Genprodukte. Dabei konnte ich nachweisen, dass eine Korrelation zwischen einer hohen Ad12-E1A/E1B-Expression und einer erhöhten p300-Konzentration in den Ad12-E1-transformierten Zelllinien besteht. Die erhöhte Konzentration von p300 in diesen Zellen ist die Folge einer Stabilisierung des Kofaktors auf Proteinebene. Untersuchungen der p300-Konzentration im Verlauf der Infektion permissiver Zellen mit Ad12-Viren zeigten, dass das Einsetzen der Ad12-E1A-Expression mit einer Erhöhung der Konzentration von p300 korreliert. Diese Ergebnisse belegen, dass eine hohe p300-Konzentration der Transformation primärer BMK-Zellen durch Ad12-E1A/E1B nicht per se entgegenwirkt. Aufbauend auf den Ergebnissen meiner Untersuchungen soll nun durch Kotransfektionsexperimente mit primären BMK-Zellen untersucht werden, ob eines der Proteine Ad12-E1A10S/11S oder Ad12-E1A9,5S die verminderte Fähigkeit zur Repression der MHC-Klasse-I-Expression durch die Genprodukte der Ad12-E1Am-Region komplementieren kann. Ferner sollen NK-Zell-Assays zur Aufklärung der Abläufe beitragen, die zu der Regression der Ad12-E1Awt-Tumoren in immunkompetenten syngenen Mäusen führen. Ein weiteres Ziel ist die detaillierte Aufklärung der Mechanismen, die zur Stabilisierung von p300 führen. Studien mit Ad12-E1A-Antisense-DNA/RNA könnten hierbei Aufschluss darüber geben, ob die hohe Ad12-E1A-Expression in den Ad12-E1A/E1B-transformierten BMK-Zelllinien für die Stabilisierung von p300 verantwortlich ist. In einem anderen Ansatz könnte der Mechanismus der Stabilisierung von p300 durch Überexpression einer E1A-Mutante, die nicht mehr an p300 oder die proteasomalen Untereinheiten S4 und S8 bindet, analysiert werden. Solche Untersuchungen könnten dazu beitragen, über die hier dargelegten Ergebnisse hinaus weitere Einsichten in die Mechanismen der onkogenen Transformation primärer Zellen und die Regulation des E1A-assoziierten Faktors p300 durch Ad12-E1A zu gewinnen.