Antivirale Cytokine in der frühen Phase der Woodchuck-Hepatitis-Virus-Infektion

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In dieser Arbeit gelang erstmalig die Klonierung, Expression und Charakterisierung von Woodchuck Cytokinen. Damit wurde die Grundlage für die immunologische Untersuchung der Hepadnavirusinfektion in einem natürlichen Infektionsmodell geschaffen. Klonierung von Woodchuck cDNAs: TNF-a, IFN-g, IL-6, IL-15, IFN-g Rezeptor, b-Aktin und CD8 In dieser Arbeit wurde der vollständige offene Leserahmen der Woodchuck Cytokine TNF-a, IFN-g, IL-6, IL-15 und die extrazelluläre Region des IFN-g Rezeptors kloniert. Desweiteren wurden Teile der offenen Leserahmen des Haushaltgens b?Aktin und des Oberflächenrezeptors CD8 kloniert. Die Klone wurden sequenziert und die erhaltenen Sequenzen auf Aminosäureebene mit den entsprechenden Sequenzen anderer Spezies verglichen. Die Woodchuckproteine sind im gleichen Maß homolog zu den entsprechenden Proteinen anderer Spezies, wie diese untereinander. Bei TNF-a, IL-6 und IL-15 sind für die Rezeptorbindung wichtige Aminosäuren bei den verschiedenen Spezies konserviert. Es zeigte sich, daß die Übereinstimmung zwischen den Woodchuck Proteinen IFN-g, IL-15 und IFN-gR und den entsprechenden menschlichen Proteinen größer ist als zwischen den Woodchuck Proteinen und den Sequenzen anderer Nager. Expression und Analyse der Woodchuck Cytokine Die Funktionalität der Cytokinklone von TNF-a, IFN-g und IL-15 konnte mittels in dieser Arbeit etablierten Bioassays nach der Transfektion in Säugerzellen nachgewiesen werden. IFN-g und TNF-a wurden zusätzlich in E. coli exprimiert, damit eine größere Menge des jeweiligen Proteins gereinigt werden konnte. Die Reinigung und die Faltung der Proteine wurde durch Größenexclusionschromatographie überprüft und die Molekulargewichte bestimmt. Beide Proteine konnten funktionell exprimiert werden. Gegen die Woodchuck Proteine TNF-a und IFN-g konnten Antiseren generiert werden, die die Proteine sowohl im Immunoblot binden, als auch ihre biologische Aktivität in vitro inhibieren. Etablierung von Testsystemen zum Nachweis von Woodchuck Cytokinen Für die Cytokine TNF-a und IL-15 wurden Bioassays etabliert, die entsprechend den Tests für die murinen Cytokine durchgeführt werden konnten. Woodchuck TNF-a konnte mit löslichem murinen TNF-a Rezeptor I neutralisiert werden. IFN-g agiert speziesspezifisch, deshalb wurde für den Schutzassay die Woodchuckzellinie 12/6 benutzt. Woodchuck IFN-g konnte wie erwartet nicht mit humanem löslichem IFN-g Rezeptor neutralisiert werden. Die Bioassays zum Nachweis von TNF-a und IFN-g sind für die Quantifizierung der Cytokine aus Woodchuckserum geeignet. Für den Nachweis der Cytokine und T-Zellmarker aus Woodchuckgewebe konnte ein RNAse Protection Assay etabliert werden. TNF-a, IFN-g, CD3 und CD4 konnten mittels RNAse Protection Assay aus stimulierten Woodchucklymphozyten nachgewiesen werden. Es ist möglich mehrere mRNA Spezies in einem Hybridisierungsansatz nachzuweisen. Desweiteren wurden Plasmide für den Nachweis von IL?15, CD8 und b-Aktin kloniert. In vivo Neutralisation von IFN-g und TNF-a Vier Woodchucks wurden während einer Infektion mit WHV mit den in dieser Arbeit generierten und gereinigten Antikörpern behandelt. Diese Behandlung hatte keinen Einfluß auf die WHV Replikation, da die Kaninchenantikörper zu schnell abgebaut wurden. Aus diesem Grund ist die extrazelluläre Region des Woodchuck IFN-g Rezeptors kloniert worden. Das Experiment soll zukünftig mit löslichem TNF-a und IFN-g Rezeptor durchgeführt werden.
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Dokumententyp:
Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Fakultät / Institut:
Medizinische Fakultät » Universitätsklinikum Essen » Institut für Virologie
Fakultät für Biologie
Dewey Dezimal-Klassifikation:
500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit
Stichwörter:
HBV, WHV
Sprache:
Deutsch
Kollektion / Status:
Dissertationen / Dokument veröffentlicht
Datum der Promotion:
05.04.2000
Dokument erstellt am:
05.04.2000
Promotionsantrag am:
15.06.2000
Dateien geändert am:
05.04.2000
Medientyp:
Text