Methodenentwicklung zur ortsaufgelösten Untersuchung und Elementquantifizierung von Gewebeschnitten und von cis-Platin behandelten CHO-Zellen mittels Plasma-Massenspektrometrie nach Laser-Ablation

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Die Laser-Ablation ist als Probenaufgabesystem der ICP-MS zur direkten Feststoffanalyse eine noch relativ junge Technik. Sie wurde erst 1985 erstmals hierfür angewandt und hat sich seitdem schnell weiterentwickelt. Die an sich einfache Methode besitzt jedoch ein großes Problem: Der Laser-Ablationsprozess ist stark von der Probenmatrix abhängig. Da es sich bei der LA-ICP-MS zusätzlich um eine direkte Feststoffanalysenmethode handelt, ist es für die meisten Anwendungen mit dem Ziel einer quantitativen Elementbestimmung schwer, den allgemein üblichen Weg der Kalibration mittels Standardadditionstechnik zu beschreiten. Hauptprobleme hierbei sind die Einbringung eines Standards in die Probe an sich, sowie die Realisierung einer genügend hohen Homogenität, da die Größenordnung der lateralen Auflösung einer Analyse mittels LA-ICP-MS im Mikrometerbereich liegt.

Ziel dieser Arbeit ist es, das Quantifizierungsproblem der LA-ICP-MS für die speziellen Fälle der Untersuchung von biologischen Gewebeschnitten sowie einzelnen Zellen aus Zellkulturen zu lösen und daneben das verwendete LA-System zu charakterisieren und auf die betreffenden Anwendungen hin zu optimieren.

Zunächst wird die Optimierung des LA-Systems beschrieben. Hier findet als erster Schritt die Umstellung des Ablationsgases von Argon auf Helium statt, was eine Verbesserung der Sensitivität um den Faktor zwei zur Folge hat. Desweiteren wird das Volumen der vorhandenen Ablationskammer durch die Einführung eines neuen Einsatzes für die Ablationskammerschublade so weit reduziert, wie es ohne einen massiven, kostenintensiven Umbau oder eine Neuentwicklung des Probenaufgabesystems möglich ist. Dies bringt eine Reduktion des effektiven Ablationskammervolumens um ca. 20% mit sich. Die anschließende ortsaufgelöste Untersuchung des Auswaschverhaltens mittels Einzelschussanalysen zeigt eine signifikante Verbesserung des Auswaschverhaltens durch die Volumenreduktion. Desweiteren wird festgestellt, dass es sich in der Ablationkammer um laminare Strömungsverhältnisse handelt, die ähnlich denen in einer zylindrischen Ablationskammer sind, wie sie in der Literatur beschrieben sind.

Zur Untersuchung von gefrorenen Proben wird die käuflich von der Firma New Wave Technologies erworbene Kryozelle installiert und die Temperatursteuerung charakterisiert. So kann festgestellt werden, dass idealerweise bei programmierten Temperaturen von unter -25 °C gearbeitet werden sollte, um das Probenmaterial wirksam am Auftauen zu hindern, da die Oberflächentemperatur der Probe auf Grund des nicht vorgekühlten Ablationsgasstroms von der eingestellten Kerntemperatur der Kryozelle deutlich nach oben hin abweicht. Durch Entwicklung eines passenden Einsatzes in die Kryozellenablationskammerschublade wird hier eine identische volumenreduzierte Kammergeometrie erreicht, wie bei der normalen Ablationskammer.
Eine Vereinfachung des Einstellungsverfahrens der P/A-Faktoren wird durch die Verwendung des hochkonzentrierten Standardreferenzmaterials NIST 610 erreicht, so dass für diesen Zweck nicht mehr das Laser-Ablationssystem gegen die Flüssigkeitsaufgabe ersetzt werden muss.
Die Energiedichte der Laserstrahlung erfährt bei längeren Messungen eine deutliche negative Drift. Durch Aufnahme dieser Drift wird festgestellt, dass eine Vorwärmzeit von mindestens einer Stunde nicht unterschritten werden sollte, um einen negativen Einfluss auf die Analysenergebnisse zu vermeiden.

Die Lösung des Quantifizierungsproblems der LA-ICP-MS bezüglich der ortsaufgelösten Untersuchung von Gewebeschnitten wird anhand der Modellmatrix Schweineleber untersucht. Zunächst wird die Matrix ausführlich charakterisiert. Hierzu werden der Wassergehalt, der Glühverlust, der CHNSO-Gehalt sowie der Gehalt an Spurenelementen bestimmt.
Im nächsten Schritt wird eine Methode entwickelt wie mittels Standardaddition die LA-ICP-MS bezüglich der ortsaufgelösten Untersuchung von Schweineleber kalibriert werden kann. Der Kalibrationsstandard wird eingeführt, indem in gemahlenem, gefriergetrocknetem Gewebe der ehemalige Wassergehalt durch das gleiche Volumen eines Standards ersetzt wird.
Da dieses Verfahren jedoch sehr zeitintensiv ist und auch eine relativ große Menge an Probenmatrix benötigt, die gerade bei der Untersuchung von Gewebeproben oft nicht verfügbar ist, wird ein alternatives Kalibrationsverfahren entwickelt. Es beruht auf der Nachahmung der Probenmatrix durch ein entsprechend angesetztes Polyacrylamid-Gel, das im CHNO-Gehalt sowie im Wassergehalt der Probenmatrix entspricht, gegenüber dieser aber keinen natürlichen Spurenelementhintergrund aufweist und die Möglichkeit bietet, den Standard absolut homogen einzubringen. Es wird gezeigt, dass mittels solcher matrixangepasster, gespikter Gelschnitte die LA ICP MS extern valide für die ortsaufgelöste Untersuchung von Gewebeschnitten kalibriert werden kann. Hierzu werden die Ergebnisse sowohl mit den Aufschlussergebnissen wie auch mit den Ergebnissen aus der Standardadditionskalibration verglichen.

Ein neues hier vorgestelltes Anwendungsgebiet der LA-ICP-MS ist die Untersuchung einzelner Zellen einer Zellkultur auf ihren Elementgehalt. Mittels Einzelschussuntersuchungen kann eine ganze Zelle, dessen Position zuvor einprogrammiert wurde, auf einmal abliert werden und das erzeugte Signal durch Integration ausgewertet werden. Hierzu werden zwei Ansätze von Kalibrationsverfahren vorgestellt, miteinander verglichen und auf die Validität ihrer Ergebnisse hin überprüft.
Im ersten Verfahren werden definierte Mengen eines Standards auf einen Objektträger aufgetropft, getrocknet und anschließend die Auftragungsflächen flächendeckend mittels LA-ICP-MS untersucht. Die Integrale der Signale der verschiedenen Standardmengen liefern hierbei die Basis einer Kalibrationsgerade.
Die zweite Kalibrationstechnik ist der für die Gewebeschnitte verwendeten sehr ähnlich. Auch hierfür werden matrixangepasste Polyacrylamid-Gelschnitte hergestellt, die bereits den Kalibrationsstandard in einer bekannten Konzentration enthalten. Zur Kalibration der LA-ICP-MS werden diese Gelschnitte mit denselben Geräteparametern (Einzelschussanalysen) wie bei der Analyse der Zellen untersucht. Anhand des ablierten Gelvolumens, der bekannten Analytkonzentration im Gel und des entsprechenden Signalintegrals kann die Kalibrationsgerade erstellt werden.
Eine Validierung der Ergebnisse dieser Techniken ist bis jetzt nicht durch den sonst üblichen Weg des Vergleiches mit einem zertifizierten Standardreferenzmaterial möglich, da ein Geeignetes nicht verfügbar ist. Um dennoch die Richtigkeit der Ergebnisse zu zeigen, wird die Größe des Genoms einer CHO-Zelle als Vergleichsgröße verwendet, da ein Basenpaar der DNA genau zwei Phosphoratomen entspricht. Der Vergleich des gefundenen Phosphorgehalts einer CHO-Zelle, bei der alle Phosphorquellen außer der DNA eliminiert wurden, mit der theoretisch erwarteten Menge an Phosphor aus der DNA zeigt für die Kalibrationstechnik durch aufgetropfte Standards auf Grund mangelnder Matrixanpassung eine starke systematische Abweichung vom Erwartungswert von über einer Größenordnung, während die Technik über matrixangepasste gespikte Polyacrylgelschnitte valide Ergebnisse liefert. Mittels der Gelschnittkalibrationstechnik ist es also möglich den Spurenelementgehalt einzelner Zellen zu bestimmen. Eine Anwendung dieser neuen Untersuchungsmethode wird anhand der Analyse von cis-Platin gespikten CHO-Zellen vorgestellt. Untersucht werden die Zellen jeweils auf ihren Phosphor- und Platingehalt.
In cis-Platin gespikten CHO-Interphase-Zellen kann bei steigender Spikekonzentration ein konstanter Phosphorgehalt und ein zunehmender Platingehalt festgestellt werden. Durch Analysen von CHO-Interphase-Zellen, die entweder mit RNAse, Pepsin oder mit beidem behandelt wurden, wird gezeigt, dass nach einer Inkubation der Zellen mit cis-Platin dieses aufgenommen wird und signifikant ausschließlich an die DNA bindet. Durch die sequenzielle Untersuchung von CHO-Metaphase-Zellen mittels Lichtmikroskopie und LA-ICP-MS können lineare Abhängigkeiten zwischen der Spikekonzentration, der von den Zellen aufgenommenen Menge an cis-Platin und der Anzahl an durch cis-Platin induzierten Chromosomenabberationen pro Zelle gezeigt werden.
Das neu entwickelte Anwendungsgebiet der LA-ICP-MS der Untersuchung einzelner Zellen aus Zellkulturen hat viel Potential für die Zukunft, wo immer es um die empfindliche Einzel- oder Multielementbestimmung von Spurenkonzentrationen in Zellen geht.
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Dokumententyp:
Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Fakultät / Institut:
Fakultät für Chemie » Analytische Chemie
Dewey Dezimal-Klassifikation:
500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie » 540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
Stichwörter:
LA-ICP-MS, Methodenentwicklung
Beitragende:
Prof. Dr. rer. nat. Hirner, Alfred V. [Gutachter(in), Rezensent(in)]
PD Dr. Goedecke, Wolfgang [Gutachter(in), Rezensent(in)]
Sprache:
Deutsch
Kollektion / Status:
Dissertationen / Dokument veröffentlicht
Datum der Promotion:
04.07.2012
Dokument erstellt am:
06.07.2012
Promotionsantrag am:
28.02.2012
Dateien geändert am:
06.07.2012
Medientyp:
Text
Bezug:
09/2005 bis 07/2012