Die Rolle des Transkriptionsfaktors TRPS1 in der Skelettentwicklung

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Ziel dieser Arbeit war, die Wirkung des Transkriptionsfaktors TRPS1 besser zu verstehen und in Komplexe und Signalwege einzuordnen, um die Pathogenese der assoziierten Erkrankung aufzuklären.
Im ersten Teil sollten direkte Zielgene von TRPS1 identifiziert und verifiziert werden, um Einsicht in die zelluläre Funktion dieses einzigartigen Transkriptionsfaktors zu bekommen. Hierzu sollte zum einen die Methode der ChIP-Seq unter Verwendung von chondrogen differenzierten ATDC5-Zellen dienen. Vorab wurde die Trps1-Expression in diesem System auf Proteinebene untersucht. Da der Trps1-Level acht Tage nach Induktion zum chondrogenen Wachstum maximal ist, wurden eben solche Zellen als Ausgangsmaterial für die Chromatinimmunpräzipitation verwendet. Leider konnte die erhoffte Anreicherung von Zielgenpromotoren mittels PCR-basierter Kontrollen nicht nachgewiesen werden. Aufgrund der unklaren Ausbeute der ChIP, wurde von der anschließenden Hochdurchsatzsequenzierung abgesehen. Da die Umstellung der Strategie und die damit verbundenen Vorarbeiten sehr zeitaufwändig sind, dauert dieser Projektteil zurzeit noch an. Zum anderen sollte mittels funktioneller Assays eine TRPS1-abhängige Regulation verschiedener Promotoren gezeigt werden. Hierbei stellte sich heraus, dass diese offenbar ein spezialisiertes Zellsystem mit einem spezifischen Set an Cofaktoren bedarf. Nur in primären Chondrozyten der Maus konnte die Regulation des STAT3-Promotors durch TRPS1 verifiziert werden.
In einem zweiten Teil dieser Arbeit sollte die Regulation des TRPS1-Gens untersucht werden. Mithilfe von Patienten mit einem TRPS und ungeklärter Pathogenese, konnten bislang unbekannte 5’-UTR Exons von TRPS1 identifiziert und mehrere daraus entstehende alternative Transkripte nachgewiesen werden. Ferner konnte per 5’-RACE ein alternativer Transkriptionsstart gefunden werden. Ein 1,7 kb großes Fragment aus der stromaufwärts dieses alternativen Transkriptionsstarts liegenden Region, hat Promotoraktivität in NIH/3T3-Zellen. Dieser alternative TRPS1-Promotor beinhaltet eine putative Bindestelle für den Transkriptionsfaktor Gli3, der von immenser Bedeutung für das Knochenwachstum und die Skelettentwicklung ist. In Kooperation mit dem ZMB Essen wurden vergleichende Analysen der wildtypischen und in der Gli3-Bindestelle mutierten Promotorregion durchgeführt. Durch diese Experimente konnte nachgewiesen werden, dass der alternative TRPS1-Promotor in primären Chondrozyten der Maus über diese Bindestelle stillgelegt wird. Sollte sich durch weitere Experimente bestätigen, dass dies tatsächlich über die Bindung von Gli3 passiert, so wäre der erste Faktor identifiziert, der TRPS1 direkt reguliert. Auch wenn sich dies nicht bestätigen sollte, wird die weitere Charakterisierung des Promotorkonstruktes möglicherweise dabei helfen, solche Faktoren zu bestimmen und TRPS1 in die entsprechenden Signalwege einzuordnen. Dies wiederum wird dabei helfen, die molekularen Ursachen der Entstehung der Tricho-Rhino-Phalangealen Syndrome aufzuklären und das phänotypische Spektrum der TRPS zu erweitern.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei neue genetische Aberrationen identifiziert, die zur Ausprägung eines TRPS-Phänotyps führen. Erstere war eine Deletion von stromaufwärts des TRPS1-Gens gelegenen Elementen, die die Expression dieses Gens beeinflusst. Zweitere war eine partielle Duplikation, die den ORF zerreißt und die allelische Transkriptmenge reduziert. In beiden Fällen war schon die Reduktion der Transkriptmenge eines TRPS1-Allels hinreichend für die Ausprägung eines TRPS. Demnach scheint schon eine geringe Dosisveränderung kritisch zu sein. Dies weist darauf hin, dass eine strenge Regulation der TRPS1-regulierten Gene notwendig ist und unterstreicht somit die Wichtigkeit dieses Transkriptionsfaktors für eine normale Entwicklung.
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Dokumententyp:
Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Fakultät / Institut:
Fakultät für Biologie
Dewey Dezimal-Klassifikation:
500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie » 571 Physiologie und verwandte Themen
Beitragende:
Prof. Dr. rer. nat. Horsthemke, Bernhard [Betreuer(in), Doktorvater]
Prof. Dr. Vortkamp, Andrea [Gutachter(in), Rezensent(in)]
Sprache:
Deutsch
Kollektion / Status:
Dissertationen / Dokument veröffentlicht
Datum der Promotion:
08.06.2011
Dokument erstellt am:
23.08.2011
Promotionsantrag am:
22.06.2010
Dateien geändert am:
23.08.2011
Medientyp:
Text