Die Amyloidablagerung in einem Mausmodell der Alzheimer Demenz und die Modulation der β-Amyloid-Peptidentstehung durch membranverankerte Inhibitoren

Dipl. Mol. Med. Schieb, Heinke

Dateibereich 26510

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Die genaue Pathogenese der Alzheimer Demenz ist noch ungeklärt, doch wird angenommen, dass die Aggregation und Akkumulation von bestimmten Formen des Aβ-Peptides den Auslöser für die nachfolgenden pathologischen Mechanismen bildet. Als experimentelle Modelle für die charakteristische Amyloidpathologie der Alzheimer Demenz und für die Untersuchung von möglichen auf β-Amyloid (Aβ)abzielenden Therapieansätzen, werden häufig transgene Mäuse eingesetzt, die mutierte Varianten des Amyloid-Vorläufer-Proteins (APP) exprimieren.
In einem ersten Teilprojekt dieser Arbeit sollte die altersabhängige Amyloidpathologie der APP23 Mäuse, die humanes APP mit der schwedischen Mutation exprimieren, biochemisch untersucht werden und mit humanen Alzheimer Proben verglichen werden. Ein Schwerpunkt sollte dabei der Analyse verschiedener Modifikationen des Aβ-Peptides gelten. In den APP23 Mäusen, wurde ein exponentieller zeitlicher Verlauf der Aβ-Akkumulation beobachtet, der im Einklang steht mit der „Keim-Theorie“ für die Aggregation von amyloidogenen Proteinen. Es zeigten sich grundlegende Unterschiede in der Zusammensetzung der amyloiden Ablagerungen zwischen Maus und Mensch. Während beim Menschen hautpsächlich Aβ42 abgelagert wurde, war die Hauptmenge bei der Maus das am C-Terminus um zwei Aminosäurereste kürzere Aβ40. Des Weiteren enthielten die humanen Plaques verschiedene N-terminal trunkierte Aβ Variationen, von denen eine Aβ-Form, die an Position 3 mit einem Pyroglutamat beginnt, die Hauptmenge darstellte. Diese konnten auch in den APP23 Mäusen nachgewiesen werden, jedoch in weitaus geringeren Mengen als beim Menschen. Dies verdeutlicht, dass die APP23 Mäuse die humane Amyloidpathologie nur unvollständig abbilden.
Aufgrund der biophysikalischen Eigenschaften des hydrophoben, zur Aggregation neigenden Aβ-Peptides ergaben sich methodische Schwierigkeiten. Deshalb wurde eine Extraktionsmethode, die für die Extraktion von Aymloidproteinen bei peripheren Amyloidosen entwickelt wurde, modifiziert und erstmals auf die Gewebextraktion von Aβ angewendet. Dadurch gelang es, das Amlyoid aus dem Gewebe in Reinstwasser zu lösen und die fibrilläre Struktur im Elektronenmikroskop darzustellen. Kontaminationsproblemen bei der 2DE durch adhäsive Aβ-Peptide, wurden durch die Entwicklung eines mehrstufigen Reinigungsprotokolls, das die Behandlung mit Proteinase K einschließt, begegnet.
In einem zweiten Teilprojekt sollten in primären neuronalen Zellen und in Zelllinien membranverankerte BACE Inhibitoren mit verschiedenen Pharmakophoren, unterschiedlichen Linkerlängen und Variationen von Lipid-Ankern charakterisiert werden. BACE ist die hauptsächliche β-Sekretase, die enzymatische Aktivität, die den ersten Schritt bei der Aβ-Generierung katalysiert. Der mittels Dihydrocholesterol und einem 89 Å Linker in der Membran verankerte Inhibitor war in allen Zellmodellen weitaus effektiver als der entsprechende freie Inhibitor in der Reduktion der Menge an sezernierten Aβ-Peptiden. Es zeigte sich, dass Inhibitoren, die einen Anker enthielten, der vornehmlich in „Lipid Raft“ inserierte, effektiver waren als andere, weniger oder nicht „raftophile“ Lipid-Anker. Zusätzlich konnte durch Anpassung des Abstandes des Inhibitors von der Membran, der Inhibitor weiter optimiert werden. Interessanterweise hatten die Inhibitoren unterschiedliche Effekte auf Wild-Typ APP und auf APP mit der schwedischen Doppelmutation, die sich direkt vor der β-Sekretase Schnittstelle im APP befindet. Auch entstanden in der Gegenwart von BACE-Inhibitoren aus APP Wild-Typ geringe Mengen an Aβ-Peptiden, die möglicherweise modifizierte N-Termini aufwiesen und nicht in den mit APPsw transfizierten Zellen detektiert wurden. Da N-terminal modifizierte und / oder verkürzte Aβ-Peptide einen großen Anteil in humanen Plaques ausmachen, könnte deren Entstehung pathophysiologische Bedeutung haben.
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Dokumententyp:
Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Fakultät / Institut:
Fakultät für Biologie
Dewey Dezimal-Klassifikation:
500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beitragende:
Dr. Küppers, Klaus [Betreuer(in), Doktorvater]
Wiltfang, Jens [Gutachter(in), Rezensent(in)]
Sprache:
Deutsch
Kollektion / Status:
Dissertationen / Dokument veröffentlicht
Datum der Promotion:
16.03.2011
Dokument erstellt am:
30.03.2011
Promotionsantrag am:
03.12.2010
Dateien geändert am:
30.03.2011
Medientyp:
Text