Pharmako-epigenetische Untersuchungen zur Therapieresistenz im Neuroblastom

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Aberrante DNS-Methylierungen sind mit der Krebsentstehung und Entwicklung von Chemotherapie-Resistenzen, einer großen Hürde bei der Behandlung rezidivierender Neuroblastome (NB), assoziiert. In dieser Arbeit wurde in chemotherapieresistenten und –sensitiven Neuroblastomen nach Genen gesucht, die durch Unterschiede in ihrer epigenetischen Regulation und Expression an der Entwicklung einer Therapieresistenz beteiligt sein können. Dazu wurde in chemotherapie-resistent gezüchteten NB Zellen ein Microarray basiertes Screening (DMH-Analyse) unter Verwendung einer 14.000 CpG-Inseln umfassenden Bibliothek durchgeführt. In diesem präklinischen Modell wurde das Zinkfingerprotein-Gen ZFP37 identifiziert, welches in Doxorubicin-resistenten LAN1 und Kelly Zellen und in Cisplatin-resistenten Kelly Zellen im Vergleich zu sensitiven Zellen hypermethyliert vorlag. Expressionsanalysen bestätigten die transkriptionale Repression von ZFP37 in resistenten versus sensitiven Zellen. Die ZFP37-Proteinexpression nahm in sensitiven Zellen dosisabhängig unter Doxorubicin-Inkubation zu, während sie in DoxoR Zellen weiter abnahm, was einen Mechanismus zur Expressionsinhibierung in resistenten Zellen nahelegt. Demethylierung der Zellen durch Behandlung mit 5-Aza-2´-deoxycytidin stellte die ZFP37-Expression wieder her. Durch Bisulfit-Sequenzierung und Combined Bisulfite Restriction Analysis (COBRA) wurden leichte Differenzen zwischen der ZFP37 Methylierung in resistenten und sensitiven Zellen festgestellt. Die für die verminderte Expression verantwortliche Hypermethylierung liegt jedoch vermutlich außerhalb der analysierten Sequenzen. Quantitative Real-Time PCR Expressionsanalysen mit 68 primären Tumoren zeigten einen Zusammenhang zwischen einer verminderten ZFP37-Expression und metastasierten NB. In primären NB wurde durch Genexpressionschip-Analysen eine inverse Korrelation zwischen der Expression von ZFP37 und den resistenzassoziierten Genen MGMT und ABCC4 beobachtet. Die Inhibition der ZFP37-Expression in vitro durch shRNS-Transfektion führte nicht zu einer Repression dieser Gene, was einen übergeordneten Mechanismus zur Regulation der Expression vermuten lässt. Diese Herunterregulation von ZFP37 resultierte in einer gesteigerten Resistenz gegen Doxorubicin und Irinotecan. Die entwickelte Therapieresistenz war unabhängig von der Expression des Multidrug Resistance Gens MDR1, so dass in weiteren Analysen überprüft werden muss, wie die epigenetische Inhibition von ZFP37 an der Therapieresistenz beteiligt ist. In dieser Arbeit wurde weiterhin das potentielle Tumorsuppressorgen IGSF4 auf seine epigenetische Regulation untersucht. In primären NB ist die verminderte Expression mit einer schlechten Prognose und fortgeschrittenen Stadien assoziiert. In den untersuchten primären NB war jedoch das DNS-Methylierungsmuster der Promotorregion von IGSF4 in allen Stadien gleich. Die verminderte Expression im NB wird somit im Gegensatz zu anderen Krebsarten nicht durch eine Hypermethylierung des Promotors verursacht. Da eine Deletion oder Mutation des Gens ausgeschlossen werden konnte, stehen weitere Analysen zum Regulationsmechanismus von IGSF4, wie z.B. eine Histondeacetylierung oder die Überexpression von Repressoren, aus. Für einen globalen Überblick stellen Hochdurchsatzsequenzierungen von methylierten und unmethylierten DNS Bereichen einen vielversprechenden Ansatz dar. Die Kombination der Analyse epigenetischer und genetischer Informationen wird zu einem besseren Verständnis der molekularen Resistenzmechanismen im NB beitragen.
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Dokumententyp:
Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Fakultät / Institut:
ehem. Fakultät für Biologie und Geografie
Dewey Dezimal-Klassifikation:
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit » 615 Pharmakologie, Therapie
Beitragende:
Prof. Dr. rer. nat. Opalka, Bertram [Betreuer(in), Doktorvater]
Priv.-Doz. Dr. rer. nat. Schramm, Alexander [Gutachter(in), Rezensent(in)]
Sprache:
Deutsch
Kollektion / Status:
Dissertationen / Dokument veröffentlicht
Datum der Promotion:
15.09.2010
Dokument erstellt am:
04.10.2010
Promotionsantrag am:
15.04.2010
Dateien geändert am:
04.10.2010
Medientyp:
Text