Isolation and functional characterization of the osteoblast specific gene, Tmem16f

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Die meisten Skelettelemente werden durch endochondrale Ossifikation gebildet. Das Signalmolekül Ihh spielt in diesem Prozess eine wichtige Rolle. Ihh reguliert die Proliferation und Differenzierung der Chondrozyten und die Differenzierung der Osteoblasten. Ihh koordiniert auf diese Weise die Chondrogenese mit der Osteogenese. In früheren Untersuchungen unserer Gruppe wurden verschiedene Kandidatengene identifiziert, die möglicherweise downstream von Ihh funktionieren. In der vorliegenden Arbeit wurde eines dieser Kandidatengene (Tmem16f) untersucht und der Skelettphänotyp der Tmem16f defizienten Mäusen charakterisiert. Zuerst, wurde das Tmem16f Gen in silico analysiert. Es liegt auf dem Mauschromosom 15 in der Bande 15F1. Der Genlokus erstreckt sich über 185 kb und umfasst 21 Exons. Tmem16f kodiert für ein Protein mit 911 AS. Durch 5‘-RACE wurde festgestellt, dass das zweite Exon alternativ gespliced wird. Des Weiteren wird von der von Ensembl Datenbank eine kurze Isoform vorausgesagt, die als Ano6-202 bezeichnet wird. Diese entspricht dem 3‘-Sequenzbereich der langen Isoform (Exon 13 bis 21) mit einem alternative gesplictem Exon 12b am 5‘-Ende. Weitere in silico Analysen sagen für das Tmem16f Protein acht Transmembrandomänen und sechs N-verknüpfte Glycosilierungsstellen voraus. Zweitens, wurde eine spezifische Genexpression von Tmem16f im sich entwickelten Knochen und im Periost nachgewiesen. In E 14,5 und E 16,5 Wildtyp Mäuseembryonen wird Tmem16f von Osteoblasten im sich entwickelnden Knochen und Periost neben der Ihh-Expressionsdomäne exprimiert. Da in Ihh-, Runx2- bzw. Osx- defizienten Mutanten keine Tmem16f Expression detektierbar ist, scheint Tmem16f downstream von Ihh, Runx2 und Osx zu agieren. Drittens, durch transfektion von einem Tmem16f-GFP Fusionskonstrukt in COS-7 Zellen konnte eine zytoplasmatische Lokalisation von Tmem16f nachgewiesen werden. Der Schwerpunkt dieser Arbeit lag auf der funktionellen Untersuchung von Tmem16f. Hierzu wurden Mausmutanten, die eine Deletion des ersten Exons des Tmem16f-Gens tragen generiert. Außerdem wurde eine zweite Mauslinie kreiert, die eine Genetrapkassette im 13. Intron enthält, wodurch es zur Unterbrechung beider Tmem16f Isoformen kommt. Bei der Analyse von Skelettpräparationen der Tmem16f Mutantenembryonen wurde festgestellt, dass beide Mauslinien den gleichen Phänotyp, einer stark verzögerten Endochondralen und Desmalen Ossifikation zeigen Die Langknochen der Gliedmaßen und die Rippen der Tmem16f-Mausmutanten sind gebogen und verkürzt im Vergleich zu Wildtypmäusen. Die Schädelnähte sind bei den Mutanten breiter als bei den Wildtypembryonen. Bei 1 Monat alten Mausmutanten sind die Knochen etwas kürzer als bei Wildtypmäusen. Die Langknochen der Gliedmassen und die Rippen sind nicht mehr gebogen. Jedoch sind Ulna und Radius bei den Mausmutanten umeinander gedreht, während diese bei Wildtypenmäusen sind parallel verlaufen. Die Analyse der endochondrale Ossifikation auf molekularer Ebene zeigte, dass die Proliferation sowie die Differenzierung der Chondrozyten bei den Tmem16f-Mausmutanten unverändert, jedoch die Ossifikation stark verzögert ist. Die Expression der frühen Osteoblastmarkern ist im Periost unverändert, aber in den Knochenbälkchen reduziert. Durch den Nachweis einer verzögerten Mineralisierung und reduzierten Osteocalcin Expressions konnte gezeigt werden, dass die Differenzierung der späten Osteoblasten verlangsamt ist. Diese Untersuchungen zeigen, dass Tmem16f für die korrekte Knochenmineralisierung während der embryonal Entwicklung notwendig ist, jedoch bei adulten Tieren eine untergeordnete Rolle spielt.
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Dokumententyp:
Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Fakultät / Institut:
ehem. Fakultät für Biologie und Geografie
Dewey Dezimal-Klassifikation:
500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie » 576 Genetik und Evolution
Beitragende:
Prof. Dr. Vortkamp, Andrea [Betreuer(in), Doktorvater]
Prof. Dr. Ehrmann, Michael [Gutachter(in), Rezensent(in)]
Sprache:
Englisch
Kollektion / Status:
Dissertationen / Dokument veröffentlicht
Datum der Promotion:
30.08.2010
Dokument erstellt am:
31.08.2010
Promotionsantrag am:
17.02.2010
Dateien geändert am:
31.08.2010
Medientyp:
Text