Analyse der gewebespezifischen Zusammensetzung des Transkriptionsfaktorkomplexes Hypoxie-induzierbarer Faktor zur Erythropoietin-Genexpression mit Hilfe von Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer

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Konietzny_Rebecca_Dissertation.pdf25.06.2010 11:11:483,29 MB
Die Expression des Gens für Erythropoietin (EPO) wird über die gewebespezifische Zusammensetzung des Transkriptionsfaktorkomplexes HIF (hypoxia-inducible factor) reguliert. In der Arbeit wurde untersucht welche Rolle HIF-1α, HIF-2α, HNF-4α (hepatocyte nuclear factor-4alpha) und RXRα (retinoic X receptor alpha) bei der EPO-Expression in den unterschiedlichen Zelltypen spielt. Aus der Arbeit geht hervor, dass für eine hypoxische Induktion des Erythropietin (EPO)-Gens ein aktiver HIF-Komplex vorhanden sein muss. Die β-Untereinheit (ARNT, aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator) alleine ist nicht transkriptionell aktiv am EPO-Gen. Durch siHIF-1α- und siHIF-2α-Experimente zeigte sich, dass sowohl in den Neuroblastomzellen der Linie SY5Y als auch in den Nierenzellen der Linie HK120 die EPO-mRNA stärker durch HIF-2α als HIF-1α kontrolliert wird. Des Weiteren fanden sich in beiden Zelltypen Hinweise darauf, dass HIF-2α ein Zielgen von HIF-1α ist. Ein aktiver HIF-Komplex allein ist jedoch nicht ausreichend für eine hypoxische Aktivierung des EPO-Gens. Innerhalb des hypoxia-responsive element (HRE) im 3´ Enhancer des EPO-Gens befinden sich außer der HIF binding site (HBS) auch ein DR-2 (direct repeat of two hexanucleotides separated by two base pairs)-Element, an das spezifisch nuclear hormone receptors (NHRs) binden können. Es hat sich gezeigt, dass diese NHRs meist gewebespezifisch vorliegen. Die Neuroblastomzellen der Linie SY5Y scheint unter anderem der RXRα mit all-trans-retinoic-acid (at-RA) als stimulierendem Liganden für die EPO-mRNA Induktion zu rekrutieren. Noch ungeklärt ist, ob RXRα als Homodimer oder als Heterodimer mit unbekanntem Partner bindet. Für die Nierenzellen der Linie HK120 konnte HNF-4α, das in der Regel als Homodimer bindet, als genregulierender NHR identifiziert werden. Obwohl die HK120-Zellen RXRα enthalten, konnte durch at-RA keine Stimulation der EPO-mRNA-Expression erreicht werden. Im Gegensatz zu den Neuroblastom-Zellen zeigte sich in den HK120-Zellen sogar, dass durch at-RA die RXRα-mRNA und HNF-4α-mRNA und in Folge die EPO-mRNA reduziert wurden. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass HNF-4α ein Zielgen von HIF-2α und HIF-1α ist, da die HNF-4α-mRNA unter Hypoxie vermindert war. Dieser Effekt ließ sich durch den Einsatz von siHIF-2α und HIF-1α wieder aufheben. Die Transfektion von Kelly Zellen mit HNF-4α verminderte die Hypoxie-induzierte EPO-Expression. Mit Hilfe der FRET-Technik konnte bewiesen werden, dass HIF-1α einen Komplex mit ARNT bildet, der jedoch einen kürzeren Abstand zueinander aufweist als für HIF-2α mit ARNT. Dabei musste HIF-2α im Gegensatz zu HIF-1α für diese Komplexbildung an die DNA gebunden sein, was sich mit Hilfe von Deletionsmutanten der DNA-bindenden Domäne von HIF-2α und HIF-1α nachweisen ließ. Eine direkte Interaktion von HNF-4α mit den einzelnen HIF-Untereinheiten (HIF-2α,-1α und ARNT) konnte nicht festgestellt werden, auch nicht, wenn ein aktiver endogener HIF-Komplex zwischen HIF-1α und ARNT bestand. Eine Interaktion muss somit über ein Adaptorprotein wie CBP zustande kommen, wobei die Interaktion des gesamten CBP mit HNF-4α offen bleibt, weil nur zwei Domänen von CBP, die CBP-CH1- und die CBP-CH3-Domäne, für die Messungen zur Verfügung standen. Es stellte sich heraus, dass nur die CH3-Domäne direkt mit HNF-4α interagieren kann. Verwendet man eine Mutante von HNF-4α (HNF-4α-C106R), die nicht an DNA binden kann, war ein engerer Komplex zur CH3-Domäne möglich. Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass das EPO-Gen durch den HIF-Komplex mit HNF-4α über das CBP-Adaptorprotein in Nierenzellen hypoxisch induziert werden kann. Gewebespezifisch bedingt kann RXRα statt HNF-4α in neuronalen Zellen agieren. Eine Interaktion von RXRα mit CBP müsste mittels FRET noch untersucht werden.
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Dokumententyp:
Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Fakultät / Institut:
Medizinische Fakultät » Universitätsklinikum Essen » Institut für Physiologie
Dewey Dezimal-Klassifikation:
500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie » 572 Biochemie
Stichwörter:
Hypoxie, HIF, Erythropoietin, HNF4a, Retinsäure, FRET
Beitragende:
Prof. Dr. Fandrey, Joachim Kurt [Betreuer(in), Doktorvater]
Prof. Dr. Meyer, Hemmo [Gutachter(in), Rezensent(in)]
Sprache:
Deutsch
Kollektion / Status:
Dissertationen / Dokument veröffentlicht
Datum der Promotion:
23.06.2010
Dokument erstellt am:
25.06.2010
Promotionsantrag am:
08.02.2010
Dateien geändert am:
30.07.2013
Medientyp:
Text