Untersuchungen zur enzymatischen Reduktion und extrazellulären Freisetzung chelatisierbarer Eisenionen

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Das zytotoxische Potential redox-aktiver, chelatisierbarer Eisenionen hängt entscheidend davon ab, wie schnell diese durch intrazelluläre Reduktionsmittel (re-)reduziert werden („Redox-Cycling”), da die eisenabhängige Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) vorwiegend durch zweiwertige Eisenionen (Fe(II)) vermittelt wird. Welche intrazellulären Reduktionsmittel das radikalgenerierende „Redox-Cycling” am effektivsten unterhalten, konnte jedoch bislang noch nicht geklärt werden. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde vergleichend untersucht, wie effektiv isolierte Zellorganellen der Rattenleber, d.h. Mitochondrien, Mikrosomen, Zellkerne und das Cytosol, Fe(III)-ATP reduzieren können. Während die Fe(III)-Reduktionsrate durch das Cytosol und die Kernfraktion generell äußerst gering ausfiel, konnten die Mitochondrien und Mikrosomen (jeweils 0,01 mg Protein/ml) in Anwesenheit von NADH (200 µM) 50 µM Fe(III)-ATP innerhalb einer Stunde fast vollständig reduzieren. Eine Extrapolation auf die Proteinverhältnisse der Rattenleber ergab, dass die Mitochondrien die mit Abstand höchste (65%) NADH-abhängige Fe(III)-Reduktionskapazität aller Zellorganellen besitzen sollten, während auf die Mikrosomen 23% der NADH-abhängigen Fe(III)-Reduktionskapazität aller Organellen entfiel; die Fe(III)-Reduktionskapazität der cytosolischen Fraktion und der Zellkernfraktion betrug lediglich 9% bzw. 2,8%. Auf Grund seiner herausragenden Bedeutung wurde das NADH-abhängige Fe(III)-Reduktionssystem der Mitochondrien genauer untersucht. Eine Beteiligung von Ascorbinsäure und dem Superoxidanionradikal (O2.-) am mitochondrialen Fe(III)-Reduktionsprozess sowie ein direkter Elektronentransfer von NADH auf Fe(III) waren nicht nachweisbar. Neben dem Ausschluss dieser prominenten, niedermolekularen Reduktionsmittel für Eisen(III), wiesen auch der hemmende Effekt von 4,5-Dihydroxyanthrachinon (Rhein) und die ermittelten Michaelis-Menten-Kinetiken auf einen durch Enzyme vermittelten Fe(III)-Reduktionsprozess hin. Eine Beteiligung der Atmungskettenenzyme an der Reduktion von Fe(III)-Ionen konnte ausgeschlossen werden, da sowohl die Atmungsketteninhibitoren Antimycin A und Rotenon als auch die Substrate Glutamat und Malat keinen Einfluss auf die NADH-abhängige Ferrireduktaseaktivität der mitochondrialen Fraktion hatten. Durch Versuche mit submitochondrialen Fraktionen konnte schließlich gezeigt werden, dass die höchste spezifische Fe(III)-Reduktaseaktivität an oder in der äußeren Mitochondrienmembran lokalisiert ist. Aus den vorliegenden Ergebnissen wurde geschlussfolgert, dass ein NADH-abhängiges mitochondriales Enzymsystem, höchst-wahrscheinlich das Cytochrom-c-Reduktasesystem der äußeren Mitochondrienmembran, entscheidend zur effektiven Reduktion der chelatisierbaren Fe(III)-Ionen beiträgt. Aufgrund des hohen Km-Wertes für Fe(III)-ATP (ca. 0,95 mM) sollte dieser enzymatische Reduktionsprozess intrazellulär vor allem dann bedeutend werden, wenn die cytosolischen Konzentrationen von NADH und chelatisierbarer Fe(III)-Ionen unter pathologischen Bedingungen stark erhöht sind. In vergleichenden Versuchen wurde weiterhin demonstriert, dass die Mitochondrien der Skelettmuskulatur (Musculus gastrocnemius) chelatisierbares Fe(III) genauso effektiv wie die Lebermitochondrien NADH-abhängig reduzieren können. Das toxische Potential von extrazellulärem, chelatisierbarem Eisen im Rahmen des mechanischen Muskeltraumas wurde anhand eines in vitro-Traumamodells näher charakterisiert. Da bekannt ist, dass infolge einer mechanischen Zerstörung von Gewebestrukturen große Mengen intrazellulärer Metabolite freigesetzt werden, die zur Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies beitragen können, wurde zunächst die Freisetzung chelatisierbarer Eisenionen nach der Schädigung (Homogenisierung) des Skelettmuskels der Ratte untersucht. Im 1:10-Homogenat des Skelettmuskels Musculus gastrocnemius konnten mit dem Fluoreszenzindikator Phen Green SK (PG SK) 5 µM chelatisierbares Eisen nachgewiesen werden, das unmittelbar nach der Zerstörung des Muskelgewebes freigesetzt wurde und dessen Konzentration über einen Beobachtungszeitraum von 24 Stunden konstant blieb. Das freigesetzte, chelatisierbare Eisen entsprach 3% des muskulären Gesamteisens und war hauptsächlich mit Makromolekülen (≥ 30 kDa), höchstwahrscheinlich Proteinen, assoziiert. Vermutlich aus sterischen Gründen wurde das PG SK-detektierbare Eisen nur zu einem sehr geringen Teil durch Apo-Transferrin gebunden. Zudem war es hoch redox-aktiv und vermittelte eine erhebliche Bildung Thiobarbitursäure-reaktiver Substanzen (TBARS) als Maß für eine Lipidperoxidation im Muskelhomogenat. Eine Beteiligung von Protoporphyrin-Eisen des Myoglobins konnte hierbei ausgeschlossen werden. Im Hinblick auf die in vivo-Situation wurde aus den vorliegenden Daten postuliert, dass infolge eines mechanischen Muskeltraumas erhebliche Mengen redox-aktiver, chelatisierbarer Eisenionen in den Blutkreislauf freigesetzt werden könnten, die nicht durch Transferrin gebunden werden und somit potentiell eisenabhängige, oxidative Schädigungsprozesse vermitteln.
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Dokumententyp:
Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Fakultät / Institut:
Fakultät für Chemie
Dewey Dezimal-Klassifikation:
500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie » 540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
Beitragende:
Prof. Dr. med. Dr. rer. nat. Groot, Herbert de [Betreuer(in), Doktorvater]
Prof. em. Dr. Dr. h.c. Sustmann, Reiner [Gutachter(in), Rezensent(in)]
Sprache:
Deutsch
Kollektion / Status:
Dissertationen / Dokument veröffentlicht
Datum der Promotion:
06.08.2008
Dokument erstellt am:
29.08.2008
Promotionsantrag am:
25.07.2008
Dateien geändert am:
10.12.2012
Medientyp:
Text