Produktionsverfahren für Di-myo-Inositol-1-1’-phosphat

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Zur Produktion von Di-myo-Inositol-1,1-phosphat im Gramm-Maßstab konnte erfolgreich ein Up- und Downshift-Prozess für Pyrococcus furiosus bei der Firma bitop AG in Witten-Annen etabliert werden. Hierzu wurde ein 30 l Bioengenering-Reaktor als Chemostat bei 98°C über vier mal vier Wochen kontinuierlich betrieben. Aus 7,5 kg Trockenzellmasse konnten 100 g DIP aufgearbeitet werden. Für eine Kostenminimierung der DIP-Produktion sollte ein rekombinanter Produktionsstamm angestrebt werden. Hierzu wurden an der Universität Duisburg-Essen die Identifizierung und Charakterisierung der im DIP-Syntheseweg noch fehlenden Enzyme, NTP-Inositol-1-phosphat Nucleotidylyltransferase (NDP-I1P-NT) und Dimyo-Inositol-1,1´-phosphat Synthase (DIPS), durchgeführt. Die vergleichende Analyse der SDS-Gel-Elektropherogramme der verschiedenen Reinigungsfraktionen legte nahe anzunehmen, dass ein 150 kDa Protein die DIPS darstellt. Partielle Sequenzierung ließ erkennen, dass das Protein dem Genprodukt eines Leserahmens im P. furiosus Genom homolog ist, der als kodierendes Gen für eine Vanadat-sensitive ATPase annotiert wurde. Die Expression des entsprechenden Leserahmens von P. woesei ergaben jedoch keine DIPS-Aktivität für das rekombinante Protein. Weitere Versuche müssten zeigen, ob der negative Befund damit begründet ist, dass das Genprodukt generell keine DIPS-Aktivität besitzt, oder dass fehlende Proteinmodifikationen oder fehlende Proteinkomponenten eine entsprechende Aktivität verhindern. Zur Identifizierung der NDP-I1P-NT wurden sechs Leserahmen von P. woesei in E. coli exprimiert, die Homologe zu Leserahmen des P. furiosus Genoms darstellen und als Gene für Zucker-Nukleotidyltransferasen annotiert waren. Einer dieser Leserahmen exprimiert ein Genprodukt, das eine Aktivität als DP-I1P-NT mit CTP aufweist. Als Basis für Strukturuntersuchungen, die zum Verständnis der Funktion und Regulation des DIP-Syntheseweges beitragen sollen, wurden Kristallisationsversuche mit den schon charakterisierten Enzymen Inositol-1-phosphat Synthase und Inositol Monophosphatase durchgeführt.
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Dokumententyp:
Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Fakultät / Institut:
Fakultät für Biologie » Mikrobiologie
Dewey Dezimal-Klassifikation:
500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Stichwörter:
Pyrococcus, Di-myo-Inositol-1, 1-Phosphat, Fermentation, kompatible Solute
Sprache:
Deutsch
Kollektion / Status:
Dissertationen / Dokument veröffentlicht
Datum der Promotion:
27.10.2005
Dokument erstellt am:
17.11.2005
Dateien geändert am:
23.12.2005
Medientyp:
Text