Klonierung und Charakterisierung neuer Guaninnukleotid-Austauschfaktoren für die GTPase Rho

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Die Aktivierung kleiner GTPasen der Rho-Familie ist eine Antwort vieler Zellen auf die Stimulation membranständiger Rezeptoren und spielt bei zahlreichen zellulären Prozessen wie der Reorganisation des Aktin-Cytoskeletts und der Stimulation der Gentranskription eine bedeutende Rolle. Der Aktivitätszustand der Rho-Proteine wird vermutlich vor allem durch die Interaktion mit entsprechenden Guaninnukleotid-Austauschfaktoren der Dbl-Familie (Rho-GEFs) positiv reguliert. Die bis heute bekannten Rho-GEFs bilden eine Familie von homologen Proteinen und zeigen zumindest hinsichtlich zweier Strukturmerkmale einen einheitlichen Aufbau, wenn sie auch ganz unterschiedliche Expressionsmuster und Spezifitäten für die verschiedenen Rho-GTPasen aufweisen. So besitzen alle bislang identifizierten Rho-GEFs ein Tandem aus katalytischer "Dbl homology" (DH)-Domäne und C-terminal benachbarter "Pleckstrin homology" (PH)-Domäne. Mit p114-Rho-GEF (114 kDa), Mono (64 kDa) und KIAA0337 (164 kDa) gelang die Identifizierung und Charakterisierung dreier neuer, für Rho(A) spezifischer Rho-GEFs, wobei KIAA0337 aufgrund der fehlenden PH-Domäne möglicherweise den ersten Vertreter einer neuen Untergruppe der Dbl-Familie darstellt. Die cDNA von Mono wurde durch Homologie-Klonierungen aus einer humanen, embryonalen Gehirn-cDNA-Bibliothek isoliert, während die cDNAs von p114-Rho-GEF und KIAA0337 vom japanischen Kazusa-DNA-Forschungsinstitut zur Verfügung gestellt wurden. Northern Blot-Analysen der Expression von Mono und KIAA0337 in verschiedenen humanen Geweben zeigten, daß beide recht gewebespezifisch exprimiert werden, und zwar Mono recht spezifisch im Gehirn und KIAA0337 als erstes Rho-GEF recht dominant im Herzen. Dagegen wird p114-Rho-GEF ubiquitär exprimiert. Die Guaninnukleotid-Austauschaktivität und die Spezifität gegenüber der GTPase RhoA wurden durch folgende in vitro-Untersuchungen belegt: Die aufgereinigten Proteine von p114-Rho-GEF, Mono und KIAA0337 katalysierten deutlich den GDP/GTP-Austausch an RhoA, hatten jedoch keinen Einfluß auf Rac1 oder Cdc42, und alle drei GEFs interagierten spezifisch mit RhoA. In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen führte die Überexpression von p114-Rho-GEF ebenso wie die Expression von Mono zur Ausbildung von Aktin-Streßfasern in J82-Zellen, wie sie für aktiviertes RhoA typisch ist, und stimulierte spezifisch über RhoA die SRF-vermittelte Gentranskription in HEK 293-Zellen. Dagegen führte die Überexpression von KIAA0337 nur zu einer sehr schwachen Ausbildung von Aktin-Streßfasern und zeigte keinen Effekt auf die SRF-vermittelte Gentranskription. Untersuchungen der Regulation der GEF-Aktivität der drei Rho-GEFs durch Messung der SRF-vermittelten Gentranskription zeigten, daß im Falle von Mono möglicherweise der C-Terminus als regulatorische Domäne der GEF-Aktivität durch G-Protein-gekoppelte Rezeptoren fungiert, vermutlich über Galpahq vermittelt. Auch p114-Rho-GEF scheint an der Aktivierung von Rho durch G-Protein-gekoppelte Rezeptoren beteiligt zu sein. Es gelang jedoch nicht, eine klare Zuordnung zu den an der Stimulation beteiligten G-Protein-Untereinheiten zu treffen. Die Aktivität von KIAA0337 unterliegt dagegen wahrscheinlich nicht der Regulation durch membranständige Rezeptoren und nachgeschaltete G-Proteine sondern einem intramolekularen Hemmechanismus durch eine Interaktion von N- und C-Terminus.
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Dokumententyp:
Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Fakultät / Institut:
Medizinische Fakultät » Universitätsklinikum Essen » Institut für Pharmakologie
Fakultät für Biologie
Dewey Dezimal-Klassifikation:
500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Stichwörter:
RhoA, Guaninnukleotid-Austauschfaktoren (GEFs), Dbl homology (DH)-Domäne, Aktin-Streßfasern, Gentranskription, Serum response factor (SRF), J82-Zellen, HEK 293-Zellen
Sprache:
Deutsch
Kollektion / Status:
Dissertationen / Dokument veröffentlicht
Datum der Promotion:
31.10.2001
Dokument erstellt am:
31.10.2001
Promotionsantrag am:
19.12.2001
Dateien geändert am:
31.10.2001
Medientyp:
Text