Retroviraler Gentransfer des Chemotherapie-Resistenzgens O 6 -Methylguanin-DNA-Methyltransferase (MGMT) in hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen

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Im Rahmen des retroviralen Transfers des Chemotherapie-Resistenzgens für die O6-Methylguanin-DNA-Methyltransferase (MGMT) zum Schutz der Hämatopoese vor chemotherapieinduzierter Myelosuppression sollten wesentliche Parameter als Vorbereitung zum klinischen Einsatz untersucht werden. Die Experimente beinhalteten sowohl in vitro Versuche an klonogenen hämatopoetischen Zellen, als auch in vivo Untersuchungen in einem prä-klinischen murinen Transplantationsmodell. Murine klonogene Vorläuferzellen konnten durch Transduktion mit dem Moloney Murine Leukemia Virus-basierenden N2/Zip-pgkpr-MGMT-Vektor effektiv vor der Zytotoxizität verschiedener Chemotherapeutika im Methylzellulosetest geschützt werden. Die wtMGMT-vermittelte Resistenz schützte sowohl vor der Toxizität verschiedener chloroethylierender Substanzen als auch vor der Triazenverbindung Temozolomid. In weiteren Experimenten wurde die Fähigkeit unterschiedlicher retroviraler Vektoren untersucht, wtMGMT in determinierten humanen Vorläuferzellen und pluripotenten unreiferen murinen High Proliferative Potential-Colony Forming Cells (HPP-CFC) zu exprimieren. Dabei vermittelten Vektoren, welche die wtMGMT-Expression direkt vom viralen Promotor in der 5? LTR steuerten, die höchste ACNU-Resistenz. Die besten Resultate wurden in diesen Experimenten mit Murine Embryonic Stem Cell Virus-basierenden- und insbesondere hybriden Spleen Focus Forming Virus/Murine Embryonic Stem Cell Virus-basierenden-Vektoren erzielt. Dies legt die Verwendung speziell für den hämatopoetischen Gentransfer optimierter Vektoren nahe, um optimale Transgenexpression in weitgehend determinierten und frühen Vorläuferzellen zu erreichen. Die Ergebnisse einer zuvor beschriebenen erhöhten Resistenz gegenüber DNA-alkylierenden Substanzen durch die Expression der MGMTV139F-Mutante in Bakterien, die einen genetisch bedingten Defekt im Reparaturmechanismus von O6-Alkylierung des Guanin besitzen, verglichen mit der Wildtyp-MGMT, konnte für die murine Leukämiezellinie L1210 nicht bestätigt werden. Im Vergleich der vermittelten Resistenz gegenüber ACNU schnitten MGMTV139F-transfizierte Zellklone im Durchschnitt in keinem Fall besser ab als eine Zellinie, die die MGMTP140A-Mutante exprimierte. In einem murinen Knochenmarktransplantationsmodell zum MGMTP140K-Gentransfer wurden letal bestrahlten Empfängertieren Knochenmarkzellen transplantiert, die mit einem MGMTP140K- und green fluorescent protein (GFP)-exprimierenden Vektor transduziert worden waren. Bei der MGMTP140K-Mutante handelt es sich um eine gegen O6-Benzylguanin resistente Variante. Die Verbindung O6-Benzylguanin ist ein spezifischer Hemmstoff der Wildtyp-MGMT. Unter Therapie mit O6-Benzylguanin plus ACNU/BCNU beziehungsweise Temozolomid konnte bei diesen Tieren eine neue Hämatopoese etabliert werden, die vor der Myelotoxizität der chemotherapeutischen Behandlung geschützt war, so daß sich die Zellzahlen im peripheren Blut noch während der Chemotherapie erholten. Die Repopulierung der Versuchstiere erfolgte größtenteils mit transgenen geschützten, funktionellen Blutzellen, deren Anreicherung sowohl im peripheren Blut, dem Knochenmark und der Milz durch Nachweis des Markergens GFP nachweisbar war. Sollten die murinen Ergebnisse sich auf das humane System übertragen lassen, empfiehlt sich für eine klinische Anwendung der MGMT-Gentherapie der Einsatz des Medikaments Temozolomid in Kombination mit O6-Benzylguanin aufgrund seiner geringeren sekundären Organtoxizitäten, verglichen mit den Nitrosoharnstoffen. Außerdem ermöglicht die Behandlung mit O6-Benzylguanin plus Temozolomid in diesem Protokoll eine effektive Selektion auf transduzierte Stammzellen
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Dokumententyp:
Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Fakultät / Institut:
Medizinische Fakultät » Universitätsklinikum Essen » Innere Klinik (Tumorforschung)
Fakultät für Biologie
Dewey Dezimal-Klassifikation:
500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit
Stichwörter:
Gentherapie, Chemotherapieresistenz, Retrovirus, DNA-Reparatur, Hämatopoese, Stammzellen, MGMT, Chloroethylnitrosoharnstoffe, ACNU, BCNU, CCNU, Temozolomide
Sprache:
Deutsch
Kollektion / Status:
Dissertationen / Dokument veröffentlicht
Datum der Promotion:
15.11.2000
Dokument erstellt am:
15.11.2000
Promotionsantrag am:
21.11.2000
Dateien geändert am:
19.03.2013
Medientyp:
Text