Identifizierung und Charakterisierung eines neuen Transaktivators mit DNA-Bindungsspezifität für die Promotorregion vom Adenovirus 12 E1A Onkogen/Tumorsuppressorgen

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Ausgangspunkt der vorliegenden Arbeit ist die in der proximalen Promotorregion des Adenovirus 12 E1A-Gens gelegene E2FII-Sequenz. Sie ist einerseits an der Transkriptionsregulation und dem bis heute nicht vollständig aufgeklärten Mechanismus der Autoregulation des Ad12 E1A-Gens beteiligt. Andererseits weist das Sequenzmotiv eine Homologie zu verschiedenen Bindungsstellen für den Transkriptionsfaktor E2F auf, der eine zentrale Rolle im Zellzyklus spielt. Das Protein sowie das entsprechende Gen waren zu Anfang der vorliegenden Arbeit unbekannt. Mit Hilfe des Hefe-"One-Hybrid"-Systems konnte ein Klon identifiziert werden der sowohl in einer anschließenden Hefemutationsstudie, als auch in einer hefeunabhängigen Bandshiftanalyse Bindungsspezifität bezüglich der E2FII-Zielsequenz zeigte. Durch Northern-Blot-Analysen konnte gezeigt werden, daß das entsprechende Gen eine Gesamttranskriptlänge von 7,5 kb aufweist und sowohl in verschiedenen Tumorzellinien, wie auch humanen Normalgeweben exprimiert wird. Die Isolierung der assoziierten cDNA-Vollängensequenz konnte mittels Kombination einer Vielzahl von molekularbiologischen Methoden erreicht werden, zu denen u.a. die klassischen Durchmusterung und PCR-Durchmusterung von Phagen-Banken, der Einsatz eines High Density Filter Library-Blots, verschiedene 5´ RACE-PCRs und der Sequenzvergleich von EST-Datenbanken zählten. Die so identifizierte 7020 bp umfassende cDNA-Vollängensequenz wurde kloniert und in vitro translatiert. Durch computergestützten Homologievergleich auf Proteinebene konnten mehrere Domänen detektiert werden: eine WW/WWP-Domäne im C-Terminus des Proteins, eine SET-Domäne und eine putative Tyrosinkinasierungsstelle. Darüberhinaus besteht eine 100%ige Homologie zu einem huntingtin-bindenden Protein, von dem bisher jedoch nur eine Teilsequenz bekannt war und dessen Vollängensequenz hiermit ebenfalls identifiziert ist. Die detektierten Homologien und Domänen unterstreichen die Vermutung, daß die in dieser Arbeit identifizierte und klonierte Gensequenz für einen Transkriptionsfaktor kodiert, und daß es sich um einen multifunktionellen Faktor handelt.
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Dokumententyp:
Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Fakultät / Institut:
Medizinische Fakultät » Universitätsklinikum Essen » Institut für Molekularbiologie (Tumorforschung)
Fakultät für Biologie
Dewey Dezimal-Klassifikation:
500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Stichwörter:
Adenovirus, Promotor, Transkription, huntingtin, E2F, one-hybrid
Sprache:
Deutsch
Kollektion / Status:
Dissertationen / Dokument veröffentlicht
Datum der Promotion:
17.05.2000
Dokument erstellt am:
17.05.2000
Promotionsantrag am:
06.10.2000
Dateien geändert am:
17.05.2000
Medientyp:
Text