Zelltyp-spezifische Ausschaltung von DNA-Reparaturgenen zur Analyse ihrer Bedeutung bei der Kanzerogenese

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In der Krebsforschung wird die Bedeutung der DNA-Reparatur bei der Tumorentstehung und Tumortherapie zunehmend deutlich. So können fehlende DNA-Reparaturfunktionen zu Mutatorphänotypen führen und die Krebsentstehung verursachen. Um die Rolle spezifischer DNA-Reparaturgene im Rahmen des komplexen Netzwerks der DNA-Reparaturprozesse analysieren zu können, sind Tiermodelle notwendig. In der vorliegenden Arbeit wurde ein neues Tiermodell der Nitrosamin-induzierten Hepatokarzinogenese etabliert, an dem der Einfluß einzelner DNA-Reparaturfunktionen auf das Zelltyp-spezifische Transformationsrisiko untersucht werden kann. In diesem Maus-Modell wird eine somatische Inaktivierung des O6-Alkylguanin-DNA Alkyltransferase (MGMT)-Gens durch konditionalen ?knockout? mit Hilfe des Cre-loxP-Systems bewirkt. Durch Ausschaltung des MGMT-Gens in einer Subpopulation der Hepatozyten, den Zielzellen der Hepatokarzinogenese, soll der Prozeß der Tumorigenese möglichst realistisch simuliert werden. Hierbei besteht die zentrale Frage darin festzustellen, ob sich frühe, aber auch spätere prämaligne Klone bevorzugt aus MGMT-defizienten oder -kompetenten Hepatozyten rekrutieren. Zur Analyse der im Alter von 14 Tagen mit einer einmaligen Nitrosamin-Dosis behandelten Tiere wurde eine in situ-PCR etabliert, die Aufschluß über den MGMT-Genotyp individueller Hepatozyten gibt. In Kombination mit histochemischen Markern kann der Anteil der jeweiligen MGMT-Allele in den Zellen prämaligner Foci untersucht werden. Entsprechend dem entwickelten Applikationsprotokoll wurde bei insgesamt 88 Tieren die Hepatokarzinogenese induziert. Es wurde ein Rekombinationsvektor für das MGMT-Gen kloniert, bei dem das letzte Exon von zwei loxP-Sequenzen flankiert war (?floxed?). Homolog rekombinante embryonale Stammzellen (ES-Zellen), bei denen das MGMT-Gen homozygot ?floxed? vorlag, zeigten eine MGMT-Aktivität (447 ± 23 fmol/mg Protein), die dem Wildtyp (wt) vergleichbar war (420 ± 52 fmol/mg). Dagegen führte die homozygote Deletion dieses Exons zu einem vollständigen Aktivitätsverlust. Entsprechend war das MGMT-Protein durch Western-Blot-Analyse nur bei den Ausgangszellen (wt) und den ?floxed? ES-Zellen nachweisbar, nicht aber bei den MGMT-deletierte ES-Zellen. Die Untersuchung der zellulären Reparaturkapazität für O6-Alkylguanin in der DNA zeigte erstmals den hohen Anteil der MGMT-vermittelten DNA-Reparatur dieses mutagenen DNA-Alkylierungsprodukts bei der Maus. Die Inaktivierung des MGMT-Gens führte zu einer drastischen Verringerung der Anteile der eliminierten O6-Methyl- (20 % versus 90 %) und O6-Ethylguanine (14 % versus 85 %) in der genomischen DNA. Bei MGMT-kompetenten Zellen wurde O6-Ethylguanin wesentlich schneller repariert als O6-Methylguanin (t½ = 3 h versus t½ = 17,5 h). Darüberhinaus zeigten die Daten eine zusätzliche MGMT-unabhängige Reparatur der O6-Alkylguanine, durch die innerhalb von 24 h 14-20 % dieser DNA-Läsionen aus der DNA eliminiert wurden. Mit Hilfe der Reimplantation rekombinanter ES-Zellen wurde eine Maus-Linie etabliert, bei der das MGMT-Gen ?floxed? vorliegt und somit durch die Cre-Rekombinase in vivo deletiert werden kann. Zur Expression der Cre-Rekombinase wurde die Cre-cDNA unter Kontrolle des humanen C-reaktiven Protein Gens (hCRP) kloniert. Mit Hilfe der Mikroinjektionstechnik wurde eine CrehCRP-transgene Maus-Linie generiert, bei der die Cre-Expression Hepatozyten-spezifisch induziert werden kann. Eine einmalige intraperitoneale Injektion von Lipopolysaccharid (LPS) (3,3 µg/g Körpergewicht) bewirkte bei doppelt transgenen Tieren (MGMT flox/flox; CrehCRP) die Deletion von ~30 % (G) und ~13 % (E) der loxP-flankierten MGMT-Allele. Eine zweite LPS-Injektion im Abstand von einer Woche erhöhte den Anteil der deletierten MGMT-Allele auf ~45 % (G) und ~35 % (E). Zur Erweiterung der analytischen Möglichkeiten auf die Basenexzisions-Reparatur (BER) wurde ein Rekombinationsvektor für das wichtige DNA-Reparaturgen APE kloniert, das für die Apurin/Apyrimidin-Endonuklease kodiert. Die Einfügung eines loxP-flankierten, vierten kodierenden Exons ermöglicht es, spezifisch die Endonuklease-Funktion unter Erhaltung der Redox-Funktion des APE-Gens zu deletieren.
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Dokumententyp:
Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Fakultät / Institut:
Medizinische Fakultät » Universitätsklinikum Essen » Institut für Zellbiologie (Tumorforschung)
Fakultät für Biologie » Genetik
Dewey Dezimal-Klassifikation:
500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Stichwörter:
MGMT, Kanzerogenese, DNA-Reparatur, CRE, Knockout, Hepatokarzinogenese, HCRP, c-reaktives, APE, AP-Endonuklease
Sprache:
Deutsch
Kollektion / Status:
Dissertationen / Dokument veröffentlicht
Datum der Promotion:
14.06.2000
Dokument erstellt am:
14.06.2000
Promotionsantrag am:
18.09.2000
Dateien geändert am:
13.02.2013
Medientyp:
Text